雙炔失碳酯

雙炔失碳酯是具有抗著床作用的避孕藥，並無孕激素活性。適用於探親或新婚夫婦使用，特別是探親2周以上多次房事的婦女。

基本資料

藥物名稱：雙炔失碳酯
英文名稱：Anordrin
簡寫拼音：SQSTZ
藥物別名：53號抗孕片、探親避孕片53號、雙炔失碳酯片
所屬類別：女性短效避孕藥
藥物說明：規格，片劑（53號抗孕片）：腸溶糖衣片，每片含雙炔失炭酯7。5mg、咖啡因20mg及30mg維生素B6。

功用作用

雙炔失碳酯

為具有抗著床作用的避孕藥、並無孕激素活性，其雌激素活性為炔雌醇的1／36。小劑量與孕激素有協同作用，大劑量則有抗孕激素活性。能抑制子宮內膜腺體的發育，同時影響受精卵的運行速度，使其與內膜發育不同步，從而不利於著床。如在月經周期前期服藥有排卵抑制作用。本品不受月經周期的限制，只需在房事後服用1片即可，適用於探親或新婚夫婦使用，特別是探親兩周以上多次房事的婦女。

用法用量

口服：每次房事後立即服53號抗孕片1片，但第一次房事後次日晨須加服1片；以後每天最多1片，每月不少於12片。如果探親結束時還未服完12片，則需每天服1片，直至服滿12片。

注意事項

甲孕酮

（1）服藥初期常見有噁心、嘔吐、頭暈、乏力、嗜睡等類早孕反應，必要時可對症處理，每天服用維生素B620mg或維生素C100mg。偶有陰道出血、白帶增多、乳脹、乳頭髮深色、腹脹、食欲不振、口乾等。
（2）少數人月經周期、經量有不同程度改變。對月經周期延長或閉經者，可加服甲孕酮25mg和炔雌醇0.015mg。
（3）肝、腎病患者、人工流產未滿半年者、哺乳期或腹瀉婦女忌用。
（4）如必須在房事前服藥者，可在事前1小時內服用。

對軟骨肉瘤的研究

研究課題：雙炔失碳酯對Swarm大鼠軟骨肉瘤在小鼠腎囊膜下生長的抑制作用。

試驗中的數據

目的：研究雙炔失碳酯(ANO)及其α異構體(α-ANO)、三苯氧胺(TAM)、順鉑(CDDP)、全反式維甲酸(ATRA)對Swarm大鼠軟骨肉瘤(SRCS)體內外生長的影響和機制。

方法：觀察藥物SRCS在小鼠腎囊腺下體內生長的影響；vonKossa法觀察藥物治療對SRCS中鈣鹽沉積的作用；用台盼藍排染法觀察了藥物對SRCS細胞體外生長的影響；以對硝基苯酚磷酸酯為底物研究藥物對SRCS細胞中鹼性磷酸酯酶(ALPase)活性的影響；用鄰甲酚酞絡合酮比色法測定SRCS細胞中的鈣含量。

結果：幾種藥物對SRCS在小鼠腎囊膜下體內生長均有程度不一的抑制作用，α-ANO在20mg/kg劑量下的生長抑制率為79。4%；CDDP、ATRA、TAM、α-ANO和ANO作用96h對SRCS細胞體外生長的IC50分別為0。45、1。47、115。2、161。7和241。5μmol/L；α-ANO和ATRA在體內可引起SRCS中出現鈣鹽沉積；在體外作用96h可使SRCS細胞中ALPase活性和鈣含量顯著性升高；而CDDP和TAM無上述現象。

結論：α-ANO和ATRA抑制SRCS生長與其誘導SRCS向成骨化方向分化有關，提示誘導分化治療可能為臨床治療軟骨肉瘤的新的有效途徑。

雌激素

Swarm大鼠軟骨肉瘤(Swarmratchondrosarcoma，SRCS)由一18個月的雌性Sprague-Dawley大鼠中形成的自發腫瘤經連續傳代分離建株而成，參照O′Neal氏軟骨肉瘤分級標準，SRCS屬2級惡性程度較高的一種，可以作為研究人軟骨肉瘤的一個良好實驗模型。
雙炔失碳酯(Anordrin，ANO)是一種A環失碳的雄甾烷衍生物，對雌激素有部分拮抗活性，作為抗著床避孕藥已被廣泛套用。1989年本實驗室首先發現它具有抗腫瘤活性，並且該活性主要來自其α異構體。
材料和方法：一、瘤株。SRCS從中國醫科院藥物研究所引種。Wistar大鼠皮下接種，每6周傳代1次。
二、藥物與主要試劑。ANO，上海第十九製藥廠生產，α-ANO由本所植化室用氧化鋁低壓層析法分離製備；CDDP，齊魯製藥廠生產；ATRA、Ⅱ型膠原酶，Sigma產品；TAM，上海華聯製藥廠生產；胰蛋白酶，Serva產品；DMEM培養基，GIBCO產品；小牛血清，華東理工大學產品；對硝基苯酚磷酸酯(p-NP)，Merck產品；鄰甲酚酞絡合酮，上海第三試劑廠產品。

胰蛋白酶

三、動物。昆明種小鼠23～25g，雌性，由中國科學院上海實驗動物中心提供。
四、方法。1。小鼠腎囊膜下移植SRCS及藥物治療。實驗前1天小鼠腹腔注射環磷醯胺(150mg/kg)作免疫抑制。選取生長4周的SRCS，在DMEM(含15%小牛血清)中無菌條件下剪成均勻的2mm3左右大小的瘤塊備用。小鼠先用水合氯醛麻醉，從背部暴露腎臟，用16號穿刺針將瘤塊移植到腎囊膜下，然後把腎臟復位，縫合切口，隨機分組，第2天開始給藥，劑量和給藥途徑見表1，共5天，第7天觀察結果。

取出荷瘤腎臟，在裝有目鏡測微尺的解剖鏡下測量瘤塊的最長徑(a)和最短徑(b)，理論瘤體積(mm3)=0。52ab2，腫瘤生長抑制率(%)=(1-給藥組瘤體積/對照組瘤體積)×100%。2。vonKossa法觀察鈣鹽沉積。荷瘤腎臟10%福馬林固定，常規包埋切片。切片覆以5%硝酸銀溶液，紫外燈下照射30～40min，然後於5%硫代硫酸鈉水溶液中處理3～5min，1%中性紅復染數秒，中性樹膠封片。3。幾種藥物對SRCS細胞體外生長的影響。

氫化可的松

SRCS原代培養：在靠近邊緣、無壞死和瘀血區域無菌剪取SRCS10g左右，去除包膜等結締組織，剪成小塊。於5%(W/V)胰蛋白酶(含等體積1mmol/LEDTA)中37℃消化1h，再用膠原酶(160u/ml)37℃消化2h，然後用100目和400目篩網過濾，收集濾液，用DMEM(含15%小牛血清，2mmol/LGln，1μmol/L氫化可的松，15mmol/LHEPES洗3次，稀釋到106/ml培養，台盼藍染色證明90%以上為活細胞。

96孔培養板上每孔接種150μlSRCS細胞(3×105/ml)，4h後加入不同濃度的各種待試藥物，培養4天后用台盼藍排染法計數各組活細胞數，計算細胞生長抑制率，由Logit法計算各藥物的IC50值。4。幾種藥物體外對SRCS細胞中鹼性磷酸酯酶(ALPase)活性的影響。接種SRCS細胞(2×105/ml)4h後加入不同濃度的各種藥物，作用96h後收集細胞，用台盼藍排染法計數活細胞數，然後用0。9%NaCl溶液(含0.2%TritonX-100)懸浮，0℃勻漿，12000×g離心15min，取上清與0.01mol/LTris-HCl反應緩衝液(pH9.0，含0.5mmol/Lp-NP和0.5mmol/LMgCl2)混勻，37℃精確保溫30min，用0.25%體積的1mol/LNaOH終止反應，在410nm處測OD值。用對硝基苯酚作標準曲線。一個酶活力單位(u)定義為37℃和pH9。0條件下，以p-N為底物30min內水解釋放出1μmol/L對基苯酚的酶量。結果以u/106細胞表示。

雙炔失碳酯

5。幾種藥物對SRCS細胞中鈣含量的影響，收集不同濃度的幾種藥物作用96h後的SRCS細胞，用0.1N鹽酸懸浮，4℃過夜後1500r/min離心5min，取上清。用鄰甲酚酞絡合酮直接比色法和Bradford法分別測定上清中的鈣濃度和蛋白質濃度，SRCS細胞中鈣含量以nmol/mg蛋白表示。

6。統計學處理。實驗數據以±s表示，先作兩組資料的方差齊性分析，方差齊時，用Student'st檢驗，方差不齊時，用Mann-Whitney檢驗比較均數差異的顯著性。
結果：一、幾種藥物對SRCS在小鼠腎囊膜下生長的影響。在幾種藥物中，CDDP和ATRA作用最強，前者在1。5mg/kg劑量下抑瘤率為87。5%(P＜0。01)，後者在20mg/kg劑量下的抑制率為90。3%(P＜0。01)。α-ANO次之，混合體ANO和TAM也有一定的抑制作用，OXL在200mg/kg劑量下對SRCS在小鼠腎囊膜下的生長無明顯影響。

骨細胞

二、幾種藥物對SRCS中的鈣鹽沉積的作用。vonKossa法染色發現對照組SRCS中基本沒有黑色顆粒，而ANO、α-ANO和ATRA治療組SRCS中出現黑色顆粒，ATRA治療組尤其明顯，表明出現了鈣鹽沉積，而在OXL、TAM和CDDP治療組中無此現象。
三、幾種藥物對SRCS體外生長的影響。CDDP和ATRA對SRCS細胞體外的生長抑制作用最顯著，與體內結果相一致，而TAM、α-ANO和ANO的作用較弱，ANO在100μmol/L濃度以下基本沒有作用。由Logit法得CDDP、ATRA、TAM、α-ANO和ANO作用96h對SRCS體外生長的IC50，依次為0。45、1。47、115。2、161。7和241。5μmol/L。
四、幾種藥物對SRCS細胞中ALPase活性的影響。α-ANO作用96h，可使SRCS細胞中ALPase活性顯著地升高，具有劑量依賴性，ATRA的作用較α-ANO更顯著，而CDDP和TAM無此作用。

細胞間質

討論：軟骨肉瘤是直源於軟骨的惡性腫瘤，發病率在惡性骨腫瘤中僅次於骨肉瘤居第二位。外科手術是臨床治療軟骨肉瘤的主要手段，但由於軟骨肉瘤多發生在髖骨、股骨、肩胛骨以及顱底等重要部位，手術治療往往為保守治療，病人最終的轉移復發率和死亡率較高，所以作為全身治療的化療越來越受到臨床上的重視。但軟骨肉瘤象其他骨和軟組織腫瘤一樣，對許多常用的化療藥不敏感。本文套用CDDP實驗治療SRCS取得了較好的療效，但毒副作用明顯，動物體重下降，甚至有動物死亡。

ATRA對SRCS的生長抑制作用也較顯著，在20mg/kg劑量下取得了90。3%的抑制率，但無明顯毒副反應。本文還首次發現α-ANO和TAM對SRCS也有一定的生長抑制作用。在體外發現，CDDP作用後，SRCS細胞大多為被台盼藍染為藍色的死細胞，而另外四種藥物作用後則多為細胞膜完整、不被台盼藍著色的活細胞，說明CDDP為典型的細胞毒藥物，而後四種藥物對於SRCS細胞應屬於細胞抑制型藥物。

對前列腺癌細胞LNCaP生長的影響

前列腺

目的：探討雙炔失碳酯α單體（αanordrin，αANO）對激素依賴人前列腺癌細胞LNCaP生長的影響。方法採用氧化鋁柱層析分離純化雙炔失碳酯(ANO)的α和β差向異構體，SRB細胞染色法檢測αANO對LNCaP細胞生長的影響及對抗雄激素擬似劑R1881促細胞生長的作用；觀察αANO作用下細胞形態學變化；ELISA法檢測αANO對LNCaP細胞分泌前列腺特異性抗原（PSA）的影響。結果常規培養液中αANO（8，12，16，24，32μmol/L）作用LNCaP細胞後，細胞存活率分別為85。8%，51。5%，40。8%，29。2%，1。0%；在去除激素培養液中，αANO抑制細胞生長作用更強，能對抗R1881的促細胞生長作用，經αANO處理的LNCaP細胞分泌PSA能力降低。

結論：αANO抑制激素依賴人前列腺癌細胞LNCaP的增殖，具有抗雄激素促細胞生長的作用。

骨質疏鬆

選擇性雌激素受體調節劑（selectiveestrogenreceptormodulators，SERM）是指能與雌激素受體相互作用，依據靶組織和激素內環境的不同而產生特異作用的-類化合物。它們對雌激素有雙相作用，即能抗雌激素又具有擬雌激素樣作用。SERM已被證實可治療乳癌、骨質疏鬆和心血管疾病；並可能預防前列腺癌（prostatecancer，Pca）。尋找新的理想的SERM是目前研究熱點。
細胞株與細胞培養，人前列腺癌細胞LNCaP（美國加洲大學洛杉磯分校癌症中心陳德桂博士惠贈）。LNCaP培養於含10%胎牛血清、青黴素100IU/mL、鏈黴素100IU/mL的IMDM培養液中，細胞貼壁成簇生長，與底物貼附力弱，增殖慢，倍增時間為72h，細胞間粘連緊密，需用含0。02%EDTA的0。25%胰酶消化。每5天換液1次，每8天傳代1次。細胞培養於37℃恆溫，體積分數為0。05的CO2，飽和濕度的培養箱中。

試驗數據

方法：氧化鋁柱層析法分離純化藥物取α，βANO混合物1g，以1∶50氧化鋁低壓柱（E。Merck氧化鋁G）分離，柱壓0。5kg/cm2，苯∶石油醚=2∶1洗脫，每流分20mL，各流分用上述流動相薄層條件檢查，單一斑點流分合併。第6～11流分合併蒸乾，用正已烷重結晶，得純β體120mg，熔點136～137℃，第18～22流分合併蒸乾，得純α單體560mg，熔點155～156℃。α單體以無水乙醇配製成12。8mmol/L的貯存液，臨用前用培養液稀釋至所需濃度，乙醇在培養液的最終體積分數不超過0。2%。
SRB法檢測α：ANO對細胞生長的作用取在常規培養液中生長的對數生長期的LNCaP細胞經充分消化後，接種於96孔板，細胞接種量約每孔8000個，每孔100μL，24h後細胞貼壁達到80%，αANO組每孔加含不同終濃度αANO（8，12，16，24，32μmol/L）的培養液100μL，對照組加等量培養液，設3個復孔，藥物與細胞共孵育5d，作用時間結束時，用SRB染色法檢測藥物對細胞生長的抑制作用：每孔加入預冷的30％三氯醋酸50μL，放置5min後置4℃固定1h，吸棄固定液，去離子水洗5遍，甩乾，空氣乾燥，每孔加入SRB液100μL，室溫放置10min，未與蛋白結合的SRB用1％醋酸洗5遍，空氣乾燥，加入10mmol/L的非緩衝Tris鹼液150μL溶解，震盪15min，515nm波長處讀取D值。計算各濃度組的存活率。存活率=D加藥組/D對照組×100%

血清

SRB法檢測α：ANO對抗雄激素的作用用無酚紅的IMDM與活性炭處理過的血清配製成特殊的去除激素的培養液。細胞在加藥物干預前在無激素培養液中預培養24h以消除常規培養液中的激素對實驗結果的干擾，在去除激素的培養液中細胞生長較為緩慢，細胞接種量提高至每孔10000個。實驗設：對照組(加等量培養液)，αANO（3，6，12，24μmol/L）與1nmol/LR1881的單獨與聯合組，給藥後各組終體積相同，每個加藥組設3個復孔，與細胞共孵育5d，SRB法染色，酶標儀測D值，計算各濃度組的存活率。
細胞形態學觀察：取常規培養液中生長的對數生長期的LNCaP細胞消化後，常規培養液稀釋，接種於6孔板，細胞量每孔50000個，加入含不同終濃度αANO（3，6，12，24μmol/L），對照組加等量培養液，藥物作用48h後，於相差顯微鏡下觀察LNCaP細胞形態的變化。

細胞

ELISA法測藥物對細胞分泌PSA的影響：取對數生長期細胞，在去除激素的IMDM培養基中培養72h後，以含0。02%EDTA的0。25%胰酶消化液充分消化成單細胞懸液，接種於96孔板，細胞量約為每孔10000個，每個濃度設3個復孔，每孔100μL，置培養箱孵育24h，細胞貼壁後每孔加含不同濃度藥液的培養液100μL，藥物作用24h後，吸取每孔上清，離心以去除上清中的少許細胞碎片。用收集到的上清液測PSA含量。為了消除由於細胞數量的變化而造成的對PSA變化的影響，將每個濃度組的細胞數量用對照組細胞數量校正，計算抑制率。檢測步驟按ELISA試劑盒說明書。
結果：αANO對LNCaP細胞生長的影響在常規培養液中，αANO(8，12，16，24，32μmol/L)作用LNCaP細胞5d後，細胞存活率分別為85。8%，51。5%，40。8%，29。2%，1。0%，低濃度表現為抑制生長，高濃度表現為細胞毒作用，呈劑量依賴性。

雙炔失碳酯

αANO對抗雄激素的促生長作用：在無激素培養液中預培養24h，LNCaP細胞經不同濃度αANO和1nmol/LR1881處理5d後，呈現不同的增殖抑制情況。單獨給予1nmol/LR1881具有促細胞生長的作用，細胞存活率為120。8%；單獨給予αANO（3，6，12，24μmol/L）細胞存活率分別為92。9%，80。1%，44。8%，22。1%。兩者聯合套用，R1881促細胞生長作用被完全抵消，存活率分別為77。9%，67。9%，37。2%，19。5%，與相同濃度無R1881組比較呈下降的趨勢(圖2)，與單獨給予R1881組比較，差別有顯著統計學意義（P<0。01）。
細胞形態學變化：12μmol/LαANO作用於LNCaP細胞48h，細胞數量減少，部分細胞發生變形，細胞變圓，體積變小；24μmol/LαANO作用下LNCaP細胞形態發生明顯變化，細胞形狀變圓，體積變小，部分細胞碎裂，細胞質空泡化，細胞表面變粗糙，呈現顆粒狀，胞間粘連減少，細胞大部分為分散的個體。

皮質醇

αANO對LNCaP細胞分泌PSA的影響：αANO能抑制LNCaP細胞分泌PSA，在1nmol/LR1881存在下，αANO抑制PSA分泌的作用更強。R1881本身可使LNCaP細胞分泌PSA增長近10倍，αANO作用細胞24h後，細胞數量變化不大，最高給藥劑量15μmol/L，細胞數量相當於對照的90%，而細胞分泌的PSA量只有對照的35%左右，降低幅度遠遠大於細胞數量的變化。有R1881組，在αANO濃度為1μmol/L和5μmol/L時，抑制率均高於無R1881組（P＜0。01）。
αANO：雙炔失碳酯α單體。n=3。與對照組比較，☆：P<0。05，☆☆：P<0。01；與R1881比較，P<0。01。
討論：Pca是與激素密切相關的惡性腫瘤，其發病與體內雄激素與雌激素之間的平衡紊亂有關，雄激素及其受體(androgenreceptor，AR)在前列腺癌變過程中起主導作用；雌激素及其受體(estrogenreceptor，ER)在前列腺癌作用尚不清楚，有學者認為雌二醇（estradiol，E2）導致老年動物高分級的前列腺上皮內瘤，E2的增加可能上調AR對睪酮的敏感性。

胺基酸

ANO在中國於20世紀60年代首次合成，早期作為避孕藥套用於臨床，效果良好。ANO的抗生育作用主要是因其具有較強的抗雌激素作用，但藥理研究表明ANO也有弱雌激素活性，具有與SERM類藥物相似特點。目前國外已有多種SERM類藥物用於Pca預防和治療的實驗研究。
本實驗結果顯示，常規培養液中αANO作用LNCaP細胞5d，對細胞生長呈現劑量依賴性的抑制作用。LNCaP是典型的激素依賴性細胞，含有突變型AR，可表達AR和ER，並能產生人類前列腺酸性磷酸酶和PSA，在雄激素刺激下，LNCaP細胞生長增快[8]。本實驗中1nmol/LR1881與LNCaP細胞共孵育5d，促生長作用可達1。2倍左右，R1881是一種合成的雄激素受體激動劑[9]，是目前國外常用的替代雄激素的實驗試劑。1nmol/LR1881刺激LNCaP細胞的生長，但在同時含有αANO和R1881組，這部分促生長作用被完全抵消，存活率與相同濃度無R1881組比較反而下降，表明αANO在雄激素存在時，對細胞抑制作用增強，能對抗雄激素引起的細胞增殖。

靶細胞

PSA由前列腺上皮細胞產生，在腺體的腺泡和上皮細胞內合成，其合成分泌由雄激素受體調控，與雄激素成正相關，是目前Pca治療的敏感的指標之一。ELISA檢測結果表明，雄激素能使LNCaP分泌PSA升高近10倍，而αANO能顯著對抗由雄激素引起的PSA增加。這個結果再次證實了αANO具有對抗雄激素的作用。由於早期Pca是激素依賴性，體內的細胞增殖主要由於雄激素水平的升高引起，αANO對抗雄激素的特點在Pca早期治療中具有一定的潛在價值。但是，αANO抗雄激素作用與其抗雌激素和弱雌激素樣作用有何聯繫，通過何種機制實現，αANO抗Pca的活性與AR及ER之間有何關係，均有待進一步研究。

相關詞條

棉酚、達那唑、甲地孕酮、丙硫氧嘧啶、雙氫速甾醇

參考文獻

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［10］胥　彬，顧　健，常美平，等.α-雙炔失碳酯對HL-60細胞誘導分化的研究〔J〕.中國癌症雜誌，1994，4：36

短效避孕藥

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