高速逆流色譜
高速逆流色譜儀基本原理
高速逆流色譜是建立在單向性流體動力平衡體系之上的一種逆流色譜分離方法，它是在研究鏇轉管的流體動力平衡時偶然發現的。當螺鏇管在慢速轉動時，螺鏇管中的兩相都從一端分布到另一端。用某一相作移動相從一端向另一端洗脫時，另一相在螺鏇管里的保留值大約50%，但這一保留量會隨著移動相流速的增大而減小，使分離效率降低。但使螺鏇管的轉速加快時，兩相的分布發生變化。當轉速達到臨界範圍時，兩相就會沿螺鏇管長度完全分開，其中一相全部占據首端的一段，我們稱這一相為首端相，另一段全部占據尾端的一段，稱為尾端相。高速逆流色譜正是利用了兩相的這種單向性分布特徵，在高的螺鏇管轉動速下，如果從尾端送入首端相，它將穿過尾端相而移向首端，同樣，如果從首端相送入尾相，它將穿過首端相而移向螺鏇管的尾端。分離時，在螺鏇管內首先注入其中的一相(固定相)，然後從合適的一端泵入移動相，讓它載著樣品在螺鏇管中無限次的分配。儀器轉速越快，固定相保留越多，分離效果越好，且大大地提高了分離速度，故稱高速逆流色譜。
色譜儀構造
儀器的中心部分：(a) ITO多層線圈分離柱，它是由100-200米長、內徑為1.6mm左右的聚四氟乙烯管沿具有適當內徑的內軸共繞十多層而成，其管內總體積可達300mL左右。(b)平衡器，它可以調節重量，它的作用是讓(a)， (b)相對於中心軸兩邊重量平衡。當在鏇轉控制器的控制下，在齒輪傳動裝置作用下，(a)，(b)同時繞中心軸作順時針或反時針的行星運動，即(a)- (b)本身既在自轉，但同時又在繞中心軸公轉，公轉轉速可從0-4000r/min。從線圈分離柱中通過中空的中心軸還同時牽引出了線圈的兩端，一端供泵入液用，一端輸出液體。儀器工作需要互不相溶的兩種液體，一相作固定相，
高速逆流色譜儀圖示特點
1. 套用範圍廣，適應性好。
高速逆流色譜儀由於溶劑系統的組成及配比可以是無限多的，因而從理論上講可以適用於任何極性範圍內樣品的分離，在分離天然化合物方面具有其獨到之處。由於聚四氟乙烯管中的固定相為液體不需要固相載體，因而可以消除固-液色譜中由於使用固相載體而帶來的吸附損失，特別適用於分離極性物質。
2. 操作簡便，容易掌握。
儀器操作簡單，對樣品的預處理要求低，一般的粗提物即可進行的製備分離或分析。
3. 回收率高。
不需要固相載體，消除了由於樣品在固相載體上的不可逆吸附和降解造成的損失，理論上樣品的回收率可達。在實驗中只要調整好分離條件，一般都有很高的回收率。
4. 重現性好。
如果樣品不具有較強的表面活性作用，酸鹼性也不強，即使多次進樣，其分離過程都保持很穩定，而且重現性相當好。
5. 分離效率高，分離量較大。
由於其與一般的色譜分離方式不同，能實現梯度洗脫和反相洗脫，亦能進行重複進樣，使其特別適用於製備性分離，產品純度高，製備量大。
分配係數
溶劑系統的選擇是同時選擇色譜分離過程的兩相，是對樣品成功分離的關鍵所在，而樣品中各組分的分配係數決定著這種溶劑系統是否合適，因此分配係數的測定是選擇溶劑系統的重要環節。目前，分配係數的測定多採用薄層色譜法、毛細管電泳法、HPLC法、生物活性分配比率法及分析型HSCCC法。
溶劑體系和溶液系統
高速逆流色譜常用基本溶劑體系表
| 被分離物質種類 | 基本兩相溶劑體系 | 輔助溶劑 |
| 非極性或弱極性物質 | 正庚（己）烷-甲醇 | 氯烷烴 |
| 正庚（己）烷-乙睛 | 氯烷烴 | |
| 正庚己烷-甲醇（或乙睛）-水 | 氯烷烴 | |
| 中等極性物質 | 氯仿-水 | 甲醇、正丙醇、異丙醇 |
| 乙酸乙酯-水 | 正己烷、甲醇、正丁醇 | |
| 極性物質 | 正丁醇-水 | 甲醇、乙酸 |
上表中是根據被分離物質的極性列出一些基本的可供參考的溶劑體系，它包括非水體系和含水體系。
溶劑系統的選擇對於HSCCC分離十分關鍵。遺憾的是到目前為止溶劑系統的選擇還沒有充分的理論依據，而是根據實際積累的豐富經驗來選擇。通常來說，溶劑系統應該滿足以下要求：溶劑系統不會造成樣品的分解或變性樣品中各組分在溶劑系統中有合適的分配係數，一般認為分配係數在0.2-5的範圍內是較為合適的，並且各組分的分配係數值要有足夠的差異，分離因子最好大於或等於1.5；溶劑系統不會干擾樣品的檢測；為了保證固定相的保留率不低於50%，溶劑系統的分層時間不超過30秒；上下兩相的體積比合適，以免浪費溶劑；儘量採用揮發性溶劑，以方便後續處理儘量避免使用毒性大的溶劑。根據溶劑系統的極性，可以分為弱極性、中等極性和強極性三類。經典的溶劑系統有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等。在實驗中，應根據實際情況，總結分析並參照相關的專著及文獻，從所需分離的物質的類別出發去尋找相似的分離實例，選擇極性適合的溶劑系統，調節各種溶劑的相對比例，測定目標組分的分配係數，最終選擇合適的溶劑系統。
影響分離效果的因素
在逆流色譜中，留在管中固定相的量是影響溶質峰分離度的一個重要因素，高保留量將會大大改進峰分離度。
高速逆流色譜書籍研究表明：螺鏇管支持件的自轉半徑r與公轉半徑R之比B值是一個影響兩相互不混溶溶劑在鏇轉螺鏇管內保留的關鍵因素。用大直徑的支持件使值進一步提高，能導致親水性溶劑體系的單向性流體動力學分布反向；反之，用小直徑的支持件使值減小，能使疏水性溶劑體系的單向性流體運動方向反向，而介於疏水性和親水性溶劑之間的中間極性溶劑，其兩相分布狀況則會受到離心力條件的影響。
溶劑體系物理因素對保留值的影響（內因）
溶劑體系的物理因素如溶劑的黏度對固定相的保留影響很大，低年度的溶劑體系可望得到高的固定相保留，界面張力和兩相間的密度差會對溶劑在臨界點附近的分層時間產生較大的影響，一般為保證固定相保留值合適，溶劑體系的分層時小於30s。
2. 轉速的影響
螺鏇管的鏇轉速度對兩相溶劑在流體動力學平衡時的體積比，也就是對固定相的保留值的影響很大，從而影響了分離效果。當然，並不是轉速越快越好，一般對於分配得不是太好的溶劑體系，如兩相體系帶有氯仿的，還要固定相分層比較慢的兩相體系，通常情況下轉速越高，越易產生乳化現象。
3. 流速的影響
流動相流速也會影響兩相的分布，一般情況下，流動相流速越大，固定相流失加重，但流速過慢會導致分離時間過長，從而造成對溶劑的浪費。
4. 溫度的影響
溫度的提高溶劑的黏度有很大的影響，一般提高溫度會獲得高的保留值，而相反降低溫度則得到低的保留值，但一般溫度不可能提高太多，因為所用的都是有機溶劑，沸點很低。
5. 相聯檢測技術
目前，可見光檢測、紫外光檢測技術在HSCCC中套用較多。但有時由於組分對可見光或紫外光無吸收，或是固定相的流失導致流出液乳化，故無法用常用光學檢測器檢測。現在己出現了HSCCC與質譜（MS）、電子電離質譜（EI-MS）、化學電離質譜（CI-MS）快速原子轟擊質譜（FAB-MS）、熱噴霧質譜（TSP-MS）和電噴霧質譜（ESI-MS）的聯用。
技術發展
二十世紀六十年代，首先在日本，隨後在美國國家醫學研究院發現了一種有趣的現象：即互不相溶的兩相溶劑在繞成螺鏇形的小孔徑管子裡分段割據，並能實現兩溶劑相之間的逆向對流。Ito及其後來者在此基礎上研究並設計製造出了一系列逆流色譜裝置，早期的是封閉型的螺鏇管行星式離心分離儀CPC（coil planet centrifuge），用於分離染料，蛋白質和細胞粒子。數年後Ito把流通機制引入到螺鏇管柱體系中，使逆流色譜和現代色譜一樣可以實現連續的的洗脫、分離、檢測和收集，並建立了兩個基本的流通體制。其中有在比較簡單的流體靜力學平衡體制HDES基礎上開發的作為分析分離的CCC、用作製備分離的DCCC以及移位腔室CCC等。另一方面，以流體動力學平衡體制HDES為基礎，研製出在重力場作用下的大製備量分離儀器和在離心力場作用下的分析型和半製備型分離儀器。
套用
中國是世界上較早開展研究逆流色譜技術的國家，它的套用範圍十分廣泛，如生物工程、醫藥、天然產物化學、有機合成、環境分析、食品、地質、生物化學、醫藥學、農業、環境、材料、化工、海洋生物以及無機離子、保健品原料、食品添加劑和化妝品等眾多領域。
1. 在食品及保健食品中的套用
HSCCC套用於食品分離的最大優勢是粗品或複雜樣品可以直接進樣，一般用於食品除毒去雜或製備生物活性物質，
蘆薈2. 在無機物的分離中的套用
高速逆流色譜套用到無機物的分離主要用於分離重金屬元素和稀土金屬元素，並成功分離鑭系元素Sm、Gd、Tb、Dy、Er、Yb效果良好。
3. 在西藥成分分離的套用
HSCCC最旱套用就是套用於抗生素分離，可以很好的分離抗生素混合物。例如，用苯一氯仿一甲醇一水（15：15：23：7）分離依羅黴素混合物；用乙醚一正己烷一甲一水（5：1：4：5）分離放射菌素混合物。
4. 天然產物有效成分上的分離套用
在中草藥的分離純化上的套用特別廣泛套用，現在也有運用高速逆流分離抗生素以及同分異構體的報導，方東升等以石油醚一丙酮一水（3：3：2）為兩相體系成功對環抱菌素進行分離純化，黃健光等以正己烷一乙酸乙醋一甲醇一水為溶劑系統成功分離鄰苯二酚和對苯二酚這對同分異構體等。
研究熱點及發展趨勢
近年來，溶劑體系的選擇範圍越來越寬泛，有人提出用超臨界二氧化碳做流動相，利用它的高擴散性、低粘度、流體特性及環境友好等其他溶劑不可比擬的優勢分離化合物，還有人提出用製冷劑做流動相的可能性。還有人提出將三相溶劑體系用於高速逆流色譜分離中，可以對寬極性範圍的樣品進行很好的分離。目前三相溶劑還只用於標準品混合物的分離，
高速逆流色譜儀pH區帶逆流色譜是一種最新發展起來的製備色譜技術，它能使樣品的負載容量提高10倍以上，即使含量很低的物質也能得到高度濃縮。它是在固定相和流動相中加入一對試劑——保留劑和洗脫劑，保留劑用來把樣品中的各組分保留在管柱內，當含有洗脫劑的流動相以一定流速穿過固定相時，由於酸鹼反應最終達到平衡。以保留劑在兩相中的濃度比標度分配係數保留劑的分配係數，溶質的分配係數與標度值的差異決定了溶質的出峰時間，根據不同組分的Pka和疏水性的不同而實現分離。其色譜峰呈逐一連線的高度濃縮的重疊很少的矩形峰狀，很像替代色譜的色譜峰形。
離子對逆流色譜是在固定相中加入適當的配體，以提高溶質在固定相中的保留值，改進峰分離度，已廣泛用於天然藥物中肽類成分、生物鹼與胺基酸等的分離。
二元模式逆流色譜法以同一兩相分配溶劑系統洗脫，既可用於正相洗脫也可用於反相洗脫。
HSCCC與質譜等其他技術的聯用也是當前的研究熱點，它把HSCCC分離的多樣性與質譜的高靈敏度檢測和結構分析特性良好地結合在一起，前景十分看好。為了克服HSCCC理論研究相對滯後的不足，有不少研究人員正從事理論研究，試圖建立完善的理論基礎來指導溶劑體系的選擇，以期使HSCCC儘快從一種分離技術發展成為一門分離科學。
HSCCC一種獨特的不用固態載體的液液分配色譜技術，是一種能實現連續有效分離的實用分離製備技術，能採用多種多樣的溶劑系統對任何極性範圍的樣品進行分離，能實現從微克、微升量級的分析分離到上百毫克、數克量級的製備提純，適用於未經嚴格處理的大量粗製樣品的中間級分離，也能與質譜儀、紅外光譜儀等分析儀器聯用進行高純度分析，套用前景十分廣闊。
參考文獻
[1]張天佑.逆流色譜技術，1991:267。
[2]Zhang TianYou，The Technology of countercurrent Chromatography 1991: 268.
[3]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.《中華本草》[M].第六卷：231，上海：上海科學技術出版社，1999。
[4]Zhang Y.Adevances in research on pharmacology of gentiopicroside.Yunnan Med.1991，12(5):304.
[5]Sun W J，Sha Z F，Gao H，et al.Determination of gentiopicroside in Gentiana macrophylla by Rp-HPLC.Chin J Phar Anal.1994，14(1):41-43.
[6]Versatiletwo-phase solvent system for alkaloid separation by high-speed counter-currentchromatography Yuan L.M.，P.Ai et al，J. Chromatogr A，2001，27 : 91.
[7]American Chemical Society．Modem Counter-Current Chromatography.ACS Symposium Series 593，1995．78-86.
[8]Ito Y. J. Chromatogr.. 1981， 214: 122-125
[9]Ito Y. J. Chromatogr.. 1981， 207: 161-170
[10]Kong Z，Rinehart K L，Miberg R M，Conway W D. J. Liq. Chrom. &Rel. Technol，1998，21(1-2): 65-82
[11]Oka H，Harada K，Ito Y. J.Chromatogr. A，1998，812: 35-22.
[12]Agnely N，Thiebaut D. J. Chromatogr. A，1997，790(1-2): 17-30.
[13]Oka F，Oka H，Ito Y. J Chromatogr.，1991，538:99-108.
[14]姜寧,陳執中. 高速逆流色譜法及其在天然藥物研究中的套用進展[J]中國民族民間醫藥雜誌, 2004,(04).
[15]周玉傑,戴玲妹,陳福明,李總成.高速逆流色譜法分離β-谷甾醇和菜油甾醇的研究[J]精細化工, 2002,(03).
[16]黃健光,李總成. 利用高速逆流色譜分離鄰苯二酚和對苯二酚[J]化學工業與工程, 2005,(03).
[17]王巧娥,王小如,曹建敏,魏海. 高速逆流色譜法分離純化甘草查爾酮甲和脹果香豆素甲[J]現代中藥研究與實踐, 2004,(S1).
[18]田桂蓮,張天佑,楊福全. 套用高速逆流色譜(HSCCC)分離純化山茱萸中的沒食子酸[J]天然產物研究與開發, 2000,(06).
化學通用分析儀器
| 化學通用分析儀器主要用於中間體、染料、醫藥、生化、環保、石油化工、食品、農藥等各類在紫外-可見光區有一定吸收的精細化工產品的分離分析。 |
