一、高速逆流色譜法的發展簡史
二十世紀六十年代，首先在日本，隨後在美國國家醫學研究院發現了一種有趣的現象：即互不相溶的兩相溶劑在繞成螺鏇形的小孔徑管子裡分段割據，並能實現兩溶劑相之間的逆向對流。Ito及其後來者在此基礎上研究並設計製造出了一系列逆流色譜裝置，早期的是封閉型的螺鏇管行星式離心分離儀CPC（coil planet centrifuge），用於分離染料，蛋白質和細胞粒子。數年後Ito把流通機制引入到螺鏇管柱體系中，使逆流色譜和現代色譜一樣可以實現連續的的洗脫、分離、檢測和收集，並建立了兩個基本的流通體制。其中有在比較簡單的流體靜力學平衡體制HDES基礎上開發的作為分析分離的CCC、用作製備分離的DCCC以及移位腔室CCC等。另一方面，以流體動力學平衡體制HDES為基礎，研製出在重力場作用下的大製備量分離儀器和在離心力場作用下的分析型和半製備型分離儀器。
二、高速逆流色譜原理記憶器的基本配置
1．高速逆流色譜技術的原理
高速逆流色譜法是建立在單向性流體動力平衡體系之上的一種逆流色譜分離方法，它是在研究鏇轉管的流體動力平衡時偶然發現的。當螺鏇管在慢速轉動時，螺鏇管中的兩相都從一端分布到另一端。用某一相作移動相從一端向另一端洗脫時，另一相在螺鏇管里的保留值大約50%，但這一保留量會隨著移動相流速的增大而減小，使分離效率降低。但使螺鏇管的轉速加快時，兩相的分布發生變化。當轉速達到臨界範圍時，兩相就會沿螺鏇管長度完全分開，其中一相全部占據首端的一段，我們稱這一相為首端相，另一段全部占據尾端的一段，稱為尾端相。高速逆流色譜正是利用了兩相的這種單向性分布特徵，在高的螺鏇管轉動速下，如果從尾端送入首端相，它將穿過尾端相而移向首端，同樣，如果從首端相送入尾相，它將穿過首端相而移向螺鏇管的尾端。分離時，在螺鏇管內首先注入其中的一相(固定相)，然後從合適的一端泵入移動相，讓它載著樣品在螺鏇管中無限次的分配。儀器轉速越快，固定相保留越多，分離效果越好，且大大地提高了分離速度，故稱高速逆流色譜。
2．高速逆流色譜色譜儀的基本配置
儀器的中心部分：(a) ITO多層線圈分離柱，它是由100-200米長、內徑為1.6mm左右的聚四氟乙烯管沿具有適當內徑的內軸共繞十多層而成，其管內總體積可達300mL左右。(b)平衡器，它可以調節重量，它的作用是讓(a)， (b)相對於中心軸兩邊重量平衡。當在鏇轉控制器的控制下，在齒輪傳動裝置作用下，(a)，(b)同時繞中心軸作順時針或反時針的行星運動，即(a)- (b)本身既在自轉，但同時又在繞中心軸公轉，公轉轉速可從0-4000r/min。從線圈分離柱中通過中空的中心軸還同時牽引出了線圈的兩端，一端供泵入液用，一端輸出液體。儀器工作需要互不相溶的兩種液體，一相作固定相，一相作移動相。儀器工作前，先將作為固定相一相的液體通過恆流泵壓入線圈分離柱，然後用進樣器將待分離的樣品按如圖所示進樣，最後用恆流泵壓入移動相，同時啟動中心部分運轉直到轉速大於600r/min。此時，兩相線上圈分離柱中具有相對運動之勢。由於移動相源源不斷的壓入，阻止了固定相的流出，同時，移動相帶著樣品線上圈分離柱中進行無限次的分配而使複雜樣品得到分離。當移動相經過檢測器時，由於不同的樣品組分會產生不同大小的信號，用記錄儀就能得到逆流色譜圖譜，同時用餾分收集器分步收集移動相就會得到複雜樣品被分開的組分。較大的製備型HSCCC，柱容積可達530m1，一次最多進樣可達20g粗品；較小的分析型的HSCCC柱容積為8m1，進樣量為幾十微克，最大轉速可達4000r/min，分析能力堪與HPLC相媲美。
在常用的HSCCC基礎上，有人提出雙向模式的高速逆流色譜" (dua-mode counter crurrent chromatography簡稱Dccc)，即前一次的流動相作下一次的固定相，洗脫方向相反。與常規的HSCCC相比，Dccc可以降低製備時間，免去柱沖洗時問，提高分離效率，不必預測溶質的保留時間和分配係數，減少了溶劑選擇的繁瑣。但目前由於溶劑體系系統不完善，套用範圍較窄。
三、高速逆流色譜法的技術特點
1．套用範圍廣，適應性好
由於溶劑系統的組成及配比可以是無限多的，因而從理論上講可以適用於任何極性範圍內樣品的分離，在分離天然化合物方面具有其獨到之處。由於聚四氟乙烯管中的固定相為液體不需要固相載體，因而可以消除固-液色譜中由於使用固相載體而帶來的吸附損失，特別適用於分離極性物質。
2．操作簡便，容易掌握
儀器操作簡單，對樣品的預處理要求低，一般的粗提物即可進行的製備分離或分析。
3．回收率高
不需要固相載體，消除了由於樣品在固相載體上的不可逆吸附和降解造成的損失，理論上樣品的回收率可達。在實驗中只要調整好分離條件，一般都有很高的回收率。
4．重現性好
如果樣品不具有較強的表面活性作用，酸鹼性也不強，即使多次進樣，其分離過程都保持很穩定，而且重現性相當好。
5．分離效率高，分離量較大
由於其與一般的色譜分離方式不同，能實現梯度洗脫和反相洗脫，亦能進行重複進樣，使其特別適用於製備性分離，產品純度高，製備量大。
6．分配係數
溶劑系統的選擇是同時選擇色譜分離過程的兩相，是對樣品成功分離的關鍵所在，而樣品中各組分的分配係數決定著這種溶劑系統是否合適，因此分配係數的測定是選擇溶劑系統的重要環節。目前，分配係數的測定多採用薄層色譜法、毛細管電泳法、HPLC法、生物活性分配比率法及分析型HSCCC法。
7、溶劑體系和溶液系統
| 被分離物質種類 | 基本兩相溶劑體系 | 輔助溶劑 |
| 非極性或弱極性物質 | 正庚（己）烷-甲醇 | 氯烷烴 |
| 正庚（己）烷-乙睛 | 氯烷烴 | |
| 正庚己烷-甲醇（或乙睛）-水 | 氯烷烴 | |
| 中等極性物質 | 氯仿-水 | 甲醇、正丙醇、異丙醇 |
| 乙酸乙酯-水 | 正己烷、甲醇、正丁醇 | |
| 極性物質 | 正丁醇-水 | 甲醇、乙酸 |
高速逆流色譜常用基本溶劑體系表
上表中是根據被分離物質的極性列出一些基本的可供參考的溶劑體系，它包括非水體系和含水體系。
溶劑系統的選擇對於HSCCC分離十分關鍵。遺憾的是到目前為止溶劑系統的選擇還沒有充分的理論依據，而是根據實際積累的豐富經驗來選擇。通常來說，溶劑系統應該滿足以下要求：溶劑系統不會造成樣品的分解或變性樣品中各組分在溶劑系統中有合適的分配係數，一般認為分配係數在0.2-5的範圍內是較為合適的，並且各組分的分配係數值要有足夠的差異，分離因子最好大於或等於1.5；溶劑系統不會干擾樣品的檢測；為了保證固定相的保留率不低於50%，溶劑系統的分層時間不超過30秒；上下兩相的體積比合適，以免浪費溶劑；儘量採用揮發性溶劑，以方便後續處理儘量避免使用毒性大的溶劑。根據溶劑系統的極性，可以分為弱極性、中等極性和強極性三類。經典的溶劑系統有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等。在實驗中，應根據實際情況，總結分析並參照相關的專著及文獻，從所需分離的物質的類別出發去尋找相似的分離實例，選擇極性適合的溶劑系統，調節各種溶劑的相對比例，測定目標組分的分配係數，最終選擇合適的溶劑系統。
四、高速逆流色譜法的套用
中國是世界上較早開展研究逆流色譜技術的國家，它的套用範圍十分廣泛，如生物工程、醫藥、天然產物化學、有機合成、環境分析、食品、地質、生物化學、醫藥學、農業、環境、材料、化工、海洋生物以及無機離子、保健品原料、食品添加劑和化妝品等眾多領域。
1．天然產物
HSCCC可採用不同物化特性的溶劑體系和多樣性的操作條件，具有較強的適應性，為從複雜的天然產物粗製品中提取不同特性(如不同極性)的有效成分提供了有利條件。因此在80年代後期，在世界範圍內的"回歸大自然"浪潮的席捲之下，HSCCC被大量用於天然產物化學成分的分析和製備分離，目前報導也最多。
例如：用正己烷／乙酸乙酯/甲醇／水(3：7：5：5)分離粉防己乾根粗提物 ；正己烷／乙酸乙酯／乙醇／水(6：3：2：5)或正己烷／乙酸乙酯／甲醇／水(1：1：I：I)體系分離紅豆杉粗提物 ；分離紫杉醇混合物採用石油醚(40-60℃)／乙酸乙酯／甲醇/水(50：70：80：65)體系比較合適；採用正己烷/乙酸乙酯／甲醇／水(3：7：5：5)有效分離肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸混合物 ；採用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/乙醇／水(5：7：5：1：1．5)五元體系分離紫杉醇和caphalornannine；氯仿／0.07 mol/L磷酸鈉 0.04 mol／L檸檬酸緩衝液體系(pH：
5.08，1：1)分離製備馬錢子鹼和番術鱉鹼 ；用氯仿/甲醇/丙酮 /水(5：6：1：4)分離挪威雲杉針葉粗提物 ；用正庚烷／乙酸乙酯／甲醇/水(3：l0：IO：7)分離雜交番茄枝種子的粗提物 等等，一般均採用下相作流動相。
其它，尚有用正己烷／乙酸乙酯／甲醇／水兩步分離紫杉醇的同系物例(eaphalonmmaine，7-epi-10-deaeetyltaxo1)等 ，第一步採用(1：1：1：1)，第二步採用(3：3：2：3或4：4：3：4)並實現製備分離，並發現甲醇含量對分離效果影響較大；還有用多維高速逆流色譜(Multidimensional HSCCC)連續分離製備異鼠李亭、4，5，7-三羥基黃酮醇 槲皮苷，採用氯仿，甲醇／水(4：3：2)體系 J。總之，HSCCC分離製備天然產物是很適合的，不但適用於極性化合物，同樣適用於非極性化合物；既可用於天然產物粗提物的去雜，也可用於最後產物的精製，甚至可一步得到純品，當分析型的HSCCC的儀器轉速達到2000r／rain以上，溶劑體系合適的情況下，分離速度可與HPLC相媲美。
中藥來自於天然植物或動物，HSCCC同樣可以套用於中藥的單味藥有效成分或方劑的有效部分的分離。例如採用正己烷/乙酸乙酯／甲醇／水(1：1：1：1)和氯仿/甲醇／水(4：3：2)體系分離何首烏的氯仿提取物得到大黃素和蜈蚣苔素(physcioue)．分離其酒精提取物，得到1，2-二苯乙烯配糖物等。用乙酸乙酯／甲醇／水(50：1：50)分離何首烏乾根的甲醇提取物，採用下相作流動相 ；用氯仿/甲醇／0.1 mol／L鹽酸(4：1．5：2)分離製備黃連的生物鹼，下相作流動相 ；用R134a/甲醇／水體系分離當歸提取物，RliM-a作流動相，甲醇/水(65：30或70：30)作固定相；用氯仿／甲醇／水(4：3：2)分離銀杏葉提取物得到4，5，7-三羥基黃酮醇，異鼠李亭，槲皮苷純物質 。總之．HSCCC在中藥方劑分離製備中尚屬空白，因此開展HSCCC在這方面的工作有重要的意義。
2．抗生素
由於可以直接向HSCCC中進粗品，抗生素的分析和製備分離也採用HSCCC。進樣量為1 mg一5 g。
一般可用疏水性體系分離抗生素。對於未知樣品，強極性組分用含有正丁醇的體系，中等疏水性體系用含有氯仿的體系，疏水性用含有正己烷的體系 。例如：用氯仿／氯化乙烯／正己烷／甲醇／水(1：1：1：3 5：1)體系分離道諾紅菌素衍生物 ．上相作流動相；用苯／氯仿，甲醇／水(15：15：23：7)分離依羅黴素( 娜in)混合物 ，進樣量100mg，上相作流動相；用乙醚征己烷，甲醇／水(5：1：4：5)分離放線菌素(acting,vein)~合物 ，進樣量達83 mg，上相作流動相；用氯仿／甲醇／水(4：4：3)體系分離殺念菌素(candicidin)衍生物 ．進樣量100 mg，上相作流動相；四氯化碳／甲醇／0．01 mol／L磷酸鉀緩衝液(pH=7)(2：3：2)分離尼達黴素(niddamycins)混合物 ．進樣量100mg；用正己烷／L酸乙酯，甲醇／水(19：1：lO：lO)分離伊維菌素(ivermectin) ，進樣量25 mg，下相作流動相；用氯仿／乙酸乙酯／甲醇／水(3：1：3：2)分離普那黴素(pristinamycins) 等等。
3．蛋白質和肽
用HSCCC分離製備蛋白或多肽的混合物最近的進展主要取決於以下3種因紊 ：採用低粘度的溶劑體系，溶劑體系大部分包含正丁醇；新型的pH區帶提取逆流色譜的出現和發展；HSCCC與離子對逆流色譜的綜合套用。後兩種逆流色譜技術將在下面詳述。例如：採用氯仿／苯／甲醇／水(15：15：23：7)分離短桿菌肽 ，進樣量可達100 mg，上相作流動相；用氯仿／乙醇／水(5：4：3)或氯仿／乙醇／甲醇／水(5：3：3：4)分離桿菌肽(Baeitrlacin) ，進樣量可達50mg；用正丁醇／O．03 mol／L三氟乙酸(1：1)分離黏菌素 ；採用正丁醇／二氯乙酸／0．1 mol／L甲酸銨(1：O．O1：0．01)、叔丁基甲基醚／乙腈／三氟乙酸(O．5％ 一5％)(2：2：3)、叔丁基甲基醚／乙腈，三氟乙酸(1％)(2：2：3)或叔丁基甲基醚／正丁醇／乙腈／Z氟乙酸(1％)(2：2：1：5)等體系均可分離二肽混合物 ，進樣量可達3∞ mg，下相作流動相；用正丁醇／0．2 mol／L甲酸銨(pH：8．5)(1：1，5o℃)或正丁醇／0．2mol／L甲酸銨(pH=9)(1：1)體系分離縮膽囊素。
4．食品
HSCCC套用於食品分離的最大優勢是粗品或複雜樣品可直接進樣，一般用於食品除毒去雜或製備生物活性物質。例如用HSCCC檢測食品中的毒素含量，分離SEA(導致食品污染的常見毒素)[28]；用正已烷／乙腈／叔丁基甲基醚(10∶10∶1)從香芹菜中分離falcarind和falcarindiel [29]；糖和PNP衍生物用HSCCC正交螺鏇管行星式離心分離，溶劑體系是正丁醇／乙酸／水(4∶1∶5)或正丁醇／甲醇／水(4∶1∶4).分離體系通過衍生可以增加分子的疏水性，從而用HSCCC實現分離。
5．無機物
HSCCC在分離無機物方面的套用主要集中於稀土元素或重金屬元素。例如用混溶的0.5mol/LDEPHA (二乙基已基磷酸鹽)和十二烷作固定相，鹽酸作流動相，富集稀有元素；用鹽酸和氯仿(溶有0.15mol/L DEPHA)(1:1)溶劑體系分離鑭系元素Sm、Gd、Tb、Dy、Er、Yb，效果良好；用EHPA(乙基已基磷酸鹽)和單-2-乙基已基醚的甲苯溶液體系作固定相，含有鑭系元家如鈥和鉺的溶液(相當於流動相)從上洗脫，在固定相中金屬元素富集，並發現了稀有元素的複合物的保留值與流動相的pH有較大關係， pH升高，保留體積提高，但是理論塔板數下降，另外，在流動相中加入銨鹽並不影響固定相保留值。根據上述方法，HSCCC可用於環境分析檢測或控制污染。雖然靈敏度較低，但是固定相能夠富集干擾的金屬離子。
6．其它
隨著技術的發展，HSCCC套用範圍逐步拓展。已經有人嘗試用HSCCC拆分消鏇化合物。例如N-十二烷醯-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺，成功地用於胺基酸的衍生物的分離。有人用HSCCC分離紫膠染料，溶劑體系是叔丁基甲基醚／正丁醇／乙醇/水(2∶2∶1∶5)，得到的物質純度在95％左右。Ma和Ito發現增加有機固定相中手性選擇性試劑的含量及增大溶劑系統的疏水性可提高色譜峰的解析度。
五、高速逆流色譜法的前景
近年來，溶劑體系的選擇範圍越來越寬泛，有人提出用超臨界二氧化碳做流動相，利用它的高擴散性、低粘度、流體特性及環境友好等其他溶劑不可比擬的優勢分離化合物，還有人提出用製冷劑做流動相的可能性。還有人提出將三相溶劑體系用於高速逆流色譜分離中，可以對寬極性範圍的樣品進行很好的分離。目前三相溶劑還只用於標準品混合物的分離， 還沒能用於具體天然產物的分離，相信進行進一步的發展在複雜天然產物以及藥物的分離中有很大套用前景。
pH區帶逆流色譜是一種最新發展起來的製備色譜技術，它能使樣品的負載容量提高10倍以上，即使含量很低的物質也能得到高度濃縮。它是在固定相和流動相中加入一對試劑--保留劑和洗脫劑，保留劑用來把樣品中的各組分保留在管柱內，當含有洗脫劑的流動相以一定流速穿過固定相時，由於酸鹼反應最終達到平衡。以保留劑在兩相中的濃度比標度分配係數保留劑的分配係數，溶質的分配係數與標度值的差異決定了溶質的出峰時間，根據不同組分的Pka和疏水性的不同而實現分離。其色譜峰呈逐一連線的高度濃縮的重疊很少的矩形峰狀，很像替代色譜的色譜峰形。
離子對逆流色譜是在固定相中加入適當的配體，以提高溶質在固定相中的保留值，改進峰分離度，已廣泛用於天然藥物中肽類成分、生物鹼與胺基酸等的分離。
雙向逆流色譜（dual-mode countercurrent chromatography,簡稱DuCCC），即兩相分別從螺鏇管兩端同時流入，又從相對應的連線埠同時流出，兩相形成真正的逆向對流。與常規的HSCCC相比，DuCCC分離速度更快，分離效率更高，不必預測溶質的保留時間和分配係數，減少了溶劑選擇的繁瑣。該項技術可套用在蛋白分離。
HSCCC與質譜等其他技術的聯用也是當前的研究熱點，它把HSCCC分離的多樣性與質譜的高靈敏度檢測和結構分析特性良好地結合在一起，前景十分看好。為了克服HSCCC理論研究相對滯後的不足，有不少研究人員正從事理論研究，試圖建立完善的理論基礎來指導溶劑體系的選擇，以期使HSCCC儘快從一種分離技術發展成為一門分離科學。
HSCCC一種獨特的不用固態載體的液液分配色譜技術，是一種能實現連續有效分離的實用分離製備技術，能採用多種多樣的溶劑系統對任何極性範圍的樣品進行分離，能實現從微克、微升量級的分析分離到上百毫克、數克量級的製備提純，適用於未經嚴格處理的大量粗製樣品的中間級分離，也能與質譜儀、紅外光譜儀等分析儀器聯用進行高純度分析，套用前景十分廣闊。
