內容簡介
《基因工程》目錄
1基因工程概述1.1基因工程概貌
1.1.1基因工程的誕生和興起
1.1.2基因工程的特點與基本步驟
1.1.3基因工程早期的開創性研究成就
1.2基因工程技術的套用與發展趨勢
1.2.1全球性的基因工程爭奪戰
1.2.2蛋白質工程的研究開發飛速發展
1.2.3轉基因動植物生產藥物的研究迅速崛起
1.2.4醫學科學研究取得巨大成就
1.2.5基因治療技術取得重大進展
1.2.6規模空前的國際《人類基因組計畫》提前完成
1.3基因工程與生物製藥
1.3.1基因工程製藥發展態勢
1.3.2主要基因工程藥物簡介
2基因工程常用的工具酶
2.1限制性核酸內切酶
2.1.1限制酶的發現
2.1.2限制酶的種類
2.1.3限制酶的命名
2.1.4Ⅱ型限制酶的特性
2.1.5限制片段末端連線
2.2DNA連線酶
2.2.1DNA連線酶連線作用的特點
2.2.2基因工程中常用的連線酶
2.2.3DNA連線酶連線作用的分子機理
2.3DNA聚合酶
2.3.1大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ
2.3.2K1enow大片段酶
2.3.3T4噬茵體DNAR聚合酶
2.3.4經修飾的T7噬茵體DNA聚合酶
2.3.5TaqDNA聚合酶及AmpliTaqTMDNA聚合酶
2.3.6反轉錄酶
2.4DNA修飾酶
2.4.1末端脫氧核苷酸轉移酶
2.4.2鹼性磷酸酶
2.4.3T4噬菌體多核苷酸激酶
2.5單鏈核酸內切酶
2.5.1Sl核酸酶
2.5.2Bal31核酸酶
2.6核酸外切酶
2.6.1核酸外切酶Ⅶ
2.6.2核酸外切酶Ⅲ
2.6.3λ核酸外切酶
3基因工程常用的克隆載體
3.1質粒載體
3.1.1質粒概述
3.1.2質粒DNA分子的特性
3.1.3質粒載體的改造和構建
3.1.4DBR322質粒載體
3.1.5DUC質粒載體
3.1.6其他重要的質粒載體
3.2λ噬菌體載體
3.2.1λ噬菌體的基本特性
3.2.2λ噬菌體基因組的結構與功能
3.2.3λ噬菌體載體的構建
3.2.4常用的λ噬菌體載體
3.2.5改良型λ噬菌體載體
3.3粘粒載體
3.3.1粘粒載體的構建
3.3.2粘粒載體的特點
3.3.3常用的粘粒載體
3.4M13噬菌體載體
3.4.1M13噬菌體的基本特性
3.4.2M13噬菌體載體的構建
3.4.3M13噬茵體載體系列的優點
3.5噬菌粒載體
3.5.1pUC118和pUCll9噬菌粒載體
3.5.2pBluescript噬菌粒載體
3.6哺乳動物細胞載體系統
3.6.1SV40載體
3.6.2牛乳頭瘤病毒（BPV）載體
3.6.3EBV病毒載體
4目的基因的製取
4.1目的基因的化學合成
4.1.1目的基因的設計
4.1.2寡聚核苷酸片段的合成
4.1.3寡核苷酸片段的分離和純化
4.1.4用寡核苷酸片段組裝目的基因
4.1.5化學合成寡核苷酸的其他用途
4.2構建基因文庫法分離目的基因
4.2.1構建基因文庫法分離目的基因的基本步驟
4.2.2真核基因組DNA文庫的構建過程
4.3酶促合成法製取目的基因
4.3.1真核生物細胞中的mRNA
4.3.2從構建的cDNA文庫中篩選目的cDNA
4.3.3RT-PCR法合成目的cDNA
5目的基因與克隆載體的體外重組
5.1目的基因與質粒載體的連線
5.1.1粘性末端連線法
5.1.2定向克隆法
5.1.3平末端連線法
5.1.4同聚物加尾法
5.1.5加人工接頭連線法
5.1.6加DNA銜接物連線法
5.1.7其他轉換末端形式連線法
5.2目的基因與入噬菌體載體的連線
5.2.1λ噬茵體載體臂DNA的製備
5.2.2λ噬菌體載體臂與外源目的DNA片段的連線
6重組克隆載體引入受體細胞
6.1基因工程受體細胞
6.1.1受體細胞的特性
6.1.2重組體分子導入受體細胞的途徑
6.2重組體DNA分子的轉化或轉染
6.2.1用氯化鈣製備新鮮的感受態細胞轉化法
6.2.2用複合劑製備感受態細胞轉化法
6.2.3高壓電穿孔轉化法（電轉化法）
6.3重組λ噬菌體DNA的體外包裝與轉導
6.3.1λ噬茵體體外包裝的基本原理
6.3.2λ噬菌體DNA的體外包裝
6.3.3包裝提取物的製備
6.3.4重組λDNA的體外包裝與感染方法
6.4重組克隆載體導人哺乳動物細胞的轉染
6.4.1磷酸鈣和DNA共沉澱物轉染法
6.4.2DEAE-葡聚糖介導轉染法
6.4.3利用Polybrene（聚季銨鹽）的DNA轉染法
6.4.4利用原生質體融合的DNA轉染法
6.4.5電穿孔法DNA轉染
7含目的基因重組體的篩選、鑑定與分析
7.1重組體（菌）的篩選
7.1.1抗生素抗性基因插入失活法
7.1.2β-半乳糖苷酶基因插入失活法
7.1.3快速細胞破碎與凝膠電泳篩選法
7.1.4放射性標記核酸探針雜交篩選法
7.1.5免疫化學篩選法
7.2重組體的鑑定
7.2.1酶切及凝膠電泳鑑定法
7.2.2southern印跡雜交法
7.2.3電鏡R-環檢測法
7.2.4基因產物鑑定法
7.3重組DNA的序列分析
7.3.1sanger-雙脫氧鏈終止法DNA測序
7.3.2Maxam-Gilbert化學修飾法DNA測序
7.3.3快速自動化DNA測序
8目的基因在宿主細胞中的表達
8.1外源目的基因在原核細胞中的表達
8.1.1原核基因表達載體的構成
8.1.2常見的原核細胞表達載體系統
8.1.3外源目的基因在原核細胞的表達形式
8.1.4在原核細胞中高效表達目的基因
8.1.5基因定點誘變技術
8.2外源目的基因在真核細胞中的表達
8.2.1真核細胞表達載體的功能元件
8.2.2酵母茵表達系統
8.2.3哺乳動物細胞表達系統
9基因工程藥物無性繁殖系的組建
9.1人胰島素原融合蛋白重組菌的組建
9.1.1重組表達質粒pJG202的構建與鑑定
9.1.2重組質粒pJG202在大腸桿菌中的表達
9.1.3融合蛋白後處理成為人胰島素原
9.2人a2b型干擾素工程菌的組建
9.2.1hIFN-a2b基因的獲得
9.2.2重組表達質粒pMZI2B的構建
9.2.3人a2b型干擾素工程菌的形成與基因的表達
9.3集落刺激因子工程菌的組建
9.3.1細胞總RNA的提取
9.3.2PCR引物的設計與合成
9.3.3RT-PCR法製備GM-CSFcDNA
9.3.4GM-CSF重組表達載體與工程菌的組建
9.4白細胞介素融合蛋白工程菌的組建
9.4.1質粒與PCR引物
9.4.2人IL-2cDNA和PE基因的末端改造
9.4.3IL2-PE-pLY5重組質粒的構建
9.5B型肝炎表面抗原重組酵母的組建
9.5.1BsAg基因重組表達質粒pLS1和pLS2的構建
9.5.2重組表達質粒的轉化及HBsAg的表達
9.5.3重組表達質粒在酵母細胞中的穩定性
9.6人組織型纖溶酶原激活劑細胞株的組建
9.6.1真核表達質粒pLFrGGI的構建
9.6.2高效表達FrGGI（tPA突變體）的CHO細胞株的獲得
9.6.3去除dhfr基因轉錄增強子的作用
9.7紅細胞生成素CHO細胞株的組建
9.7.1質粒與細胞株
9.7.2EPO真核重組表達質粒pMGL4的構建
9.7.3重組表達質粒轉染COS-7細胞及產物表達
9.7.4重組表達質粒轉染CHO-dhfr-細胞及EPO表達
9.8人腫瘤壞死因子昆蟲細胞株的組建
9.8.1含hTNF-a基因的重組質粒的構建
9.8.2共轉染與重組病毒的獲得
9.8.3重組病毒感染Sf2l細胞及hTNF-a的表達
10基因工程藥物的生產
10.1基因工程菌（細胞）的培養與發酵
10.1.1工程細菌的培養與發酵
10.1.2工程酵母的培養與發酵
10.1.3工程細胞的培養與發酵
10.2基因工程藥物的分離純化
10.2.1影響分離純化工藝設計的主要因素
10.2.2各種產物表達形式採用的分離純化方法
10.3基因工程藥物的分離純化實例
10.3.1以包涵體形式表達的rGM-CSF中試分離純化
10.3.2以分泌型表達的人a1-干擾素的分離純化
10.3.3以可溶性形式表達的rhG-CSF的分離純化
10.3.4在酵母中表達的HBsAg的分離純化
11基因工程藥物的檢驗
11.1基因工程藥物的質量控制
11.1.1主要的基因工程藥物
11.1.2基因工程藥物的特點
11.1.3基因工程藥物的質量要求
11.1.4基因工程藥物的質控要點
11.1.5基因工程藥物的製造及檢定規程
11.2基因工程藥物常用的檢驗方法
11.2.1化學檢定法
11.2.2肽圖分析法
11.2.3外源性DNA殘留量的測定
11.2.4宿主細胞蛋白雜質的檢測
11.2.5無菌試驗
11.2.6內毒素試驗
11.2.7異常毒性試驗
11.2.8熱原質試驗
11.2.9生物學活性（效價）檢定
11.3主要基因工程藥物的檢驗
11.3.1重組人胰島素的檢驗
11.3.2重組人生長激素的檢驗
11.3.3重組人干擾素的檢驗
11.3.4重組人白細胞介素的檢驗
11.3.5重組人紅細胞生成素的檢驗
11.3.6重組人集落刺激因子的檢驗
11.3.7重組人組織型纖溶酶原激活劑的檢驗
11.3.8重組人腫瘤壞死因子的檢驗
11.3.9重組B型肝炎疫苗的檢驗
華南理工出版社出版書籍（九）
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