同聚物加尾法

同聚物加尾法是指用末湍核苷酸轉移酶催化脫氨單核苷酸添加DNA的3’末端，形成同聚物尾巴的DNA連線法。

概述

同聚物加尾法

如果在連線的兩個DNA片段沒有能互補的粘性末端，可用末湍核苷酸轉移酶催化脫氨單核苷酸添加DNA的3’末端，例如一般DNA3’端加上polyG，另一股DNA加上polyC，這樣人工在DNA兩端做出能互補的共核苷酸多聚物粘性末端，退炎後能結合連線（圖20-6），這樣方法稱為同聚物加尾法。
當混合物中只有一種dNTP時，就可以形成僅由一種核苷酸組成的3′尾巴。我們特稱這種尾巴為同聚物尾巴（homopolymerictail）。

技術核心

這種方法的核心部分是，利用末端脫氧核苷酸轉移酶轉移核苷酸的特殊功能。末端脫氧核苷酸轉移酶是從動物組織中分離出來的一種異常的DNA聚合酶，它能夠將核苷酸（通過脫氧核苷三磷酸前體）加到DNA分子單鏈延伸末端的3′-OH基團上。由核酸外切酶處理過的DNA，以及dATP和末端脫氧核苷酸轉移酶組成的反應混合物中，DNA分子的3′-OH末端將會出現單純由腺嘌呤核苷酸組成的DNA單鏈延伸。這樣的延伸片段，稱之為poly（dA）尾巴（圖2-7）。反過來，如果在反應混合物中加入的是dTTP，那么DNA分子的3′-OH末端將會形成poly（dT）尾巴。因此任何兩條DNA分子，只要分別獲得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就會彼此連線起來。

其他平末端DNA片段的連線方法

常用的平末端DNA片段連線法，主要有同聚物加尾法、銜接物連線法及接頭連線法。

銜接物連線法

銜接物連線法

鏈寡核苷酸短片段。銜接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端，用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然後再通過T4DNA連線酶的作用使兩者連線起來。接著用適當的限制酶消化具銜接物的DNA分子和克隆載體分子，這樣的結果使二者都產生出了彼此互補的粘性末端。於是我們便可以按照常規的粘性末端連線法，將待克隆的DNA片段同載體分子連線起來。

DNA接頭連線法

DNA接頭連線法

DNA接頭，是一類人工合成的一頭具某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。圖中所顯示的是一種具BamHI粘性末端的典型的DNA接頭分子。當它的平末端與平末端的外源DNA片段連線之後，便會使後者成為具粘性末端的新的DNA分子，而易於連線重組。

實際使用時對DNA接頭末端的化學結構進行必要的修飾與改造，可避免處在同一反應體系中的各個DNA接頭分子的粘性末端之間發生彼此間的配對連線。

相關產品

5’RACEKit

試劑盒

本試劑盒是高靈敏度、高特異性擴增cDNA5’末端全長的試劑盒。使用RT-PCR方法擴增目的DNA時，一般很難得到全長的cDNA片段，在基因工程研究中，分析遺傳基因的全長cDNA序列十分重要。RACE法能有效解決這一問題。Bioteke5’-FullRACEKit能夠通過已知的cDNA序列，高靈敏度、高特異性地擴增cDNA的5’末端的全長序列。本試劑盒通過RNA反轉錄酶與靶RNA的已知序列互補的引物引導合成第一鏈cDNA，第一鏈cDNA的3’末端在通過末端轉移酶使之同聚物加尾；這種合成的同聚物存在於mRNA5’未知序列的上游並提供了一個引物結合位點，擴增反應的產物能克隆至T載體上。在進行試驗時，應同時進行幾個樣品的反應時，應先配製各種試劑的混合液（MasterMix），然後再分裝到每個反應管中。這樣，可使所取的試劑體積更準確，減少試劑損失，避免重複分取同一試劑。同時也可以減少實驗操作或實驗之間產生的誤差。用於cDNA合成的溶液試劑儘可能的DEPC進行處理，並在高壓滅菌後使用。有些試劑不能高壓滅菌時，首先用經過滅菌的器具、水等配製溶液後，再將溶液進行過濾除菌處理。客戶需自備試劑無水乙醇，基因特異性引物，PCR用相關試劑。
注意事項：
◆進行5′RACE實驗時，為提高RACE結果的可信度，應同時M-MLV（-）的負對照實驗。M-MLV（-）即：5′RACEAdaptor連線反應後進行RT反應時不添加M-MLV，如果M-MLV（-）的負對照實驗沒有特異性擴增，說明5′RACE結果來源於mRNA。
◆同時進行幾個樣品的反應時，應先配製各種試劑的混合液（MasterMix），然後再分裝到每個反應管中。
問題解答：
1．TotalRNA使用量是否可以增減？
可以。TotalRNA使用2μg時擴增效果較好，1μg時擴增稍弱。推薦RNA模板使用量為2μg。
2．RT-PCR反應時何時需要將RNA預變性？
RNA立體結構比較複雜，RNA不預變性時沒有得到理想結果時需要將RNA預變性。
3．5′RACE擴增的電泳結果出現多種條帶，為什麼？
原因可能是：擴增的基因為多基因家族的成員；已知序列信息有限，導致PCR擴增特異性差；mRNA5′端剪下、拼接方式不同。