概述
其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧鹼基存在條件下複製或轉錄時，如果在四管反應系統中分別按比例引入四種雙脫氧鹼基，只要雙脫氧鹼基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧鹼基的片段可繼續延長。如此每管反應體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧鹼基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止後，分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段(長度相鄰者僅差一個鹼基)，根據片段3’端的雙脫氧鹼基，便可依次閱讀合成片段的鹼基排列順序。
相關
(一) Sanger雙脫氧鏈終止法(酶法)測序程式 操作程式是按DNA複製和RNA反轉錄的原理設計的。
1.分離待測核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是雙鏈，也可以是單鏈。
2.在4隻試管中加入適當的引物、模板、4種dNTP(包括放射性標記datp，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA為模板，則用反轉錄酶），再在上述4隻管中分別加入一種一定濃度的ddNTP(雙脫氧核苷酸)。
3.與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理)結合的引物，在DNA聚合酶作用下從5’端向3’端進行延伸反應，32P隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當ddNTP摻入時，由於它在3’位置沒有羥基，故不與下一個dNTP結合，從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產生一系列不同長度的新的DNA鏈。
4.用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳同時分離4隻反應管中的反應產物，由於每一反應管中只加一種ddNTP(如ddATP)，則該管中各種長度的DNA都終止於該種鹼基(如A)處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的DNA 3’ 末端都為同一種雙脫氧鹼基。
5.放射自顯影。根據四泳道的編號和每個泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。
(二) 雙脫氧測序的示劑及具體操作步驟（以雙鏈DNA測序為例）。
1.變性雙鏈模板的製備
(1) 材料 Tris/葡萄糖緩衝液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmo1/L EDTA，50mmo1/L 葡萄糖)，1％ SDS，0.2mo1/L NaOH，異丙醇，TE緩衝液pH8.0，4mol/L LiCl，冰冷 70％和無水乙醇，2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA。
(2) 配製方法
① 取1.5ml處於對數生產期的培養菌液(含有待測病毒核酸的重組質粒模板)，離心除去上清液後，用150?l Tris/葡萄糖緩衝液 重懸菌團，在室溫下放置5分鐘。
② 加入300?l的1％SDS，0.2mol/L NaOH，顛倒混契約15次，在室溫下放置15分鐘，加入225ml 3mol/L醋酸鈉(pH4.5)，顛倒約15次混合，在冰浴中放置45分鐘，然後離心5分鐘。
③ 將650?l上清液轉移至一支新管中，加入650?l異丙醇，混合後在室溫下放置10分鐘，離心5分鐘後棄去異丙醇，抽真空乾燥沉澱。
④ 用125?l TE(pH 8.0)重新溶解DNA，加入375?l的4mol/L LiCl,在冰浴中放置20分鐘後，於4℃下離心5分鐘。
⑤ 將上清液轉移至一支新管中用飽和苯酚抽提後再用氯仿抽提，加入2倍體積的異丙醇，在室溫下沉澱30分鐘，離心5分鐘，棄去上清液。
⑥ 用冰冷的70％乙醇洗沉澱，離心5分鐘，棄去上清液並乾燥，用50?l TE緩衝液重新溶解沉澱。用紫外分光光度計測定質粒DNA含量。
⑦ 取0.2?g質粒DNA，並將體積調至9?l，加入1?l 2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA，在室溫下放置5分鐘，加入2?l 30mol/L醋酸鈉(pH 4.5)和8?l水。
⑧ 加入6?l冰冷無水乙醇，混合後在乾冰／乙醇浴中放置15分鐘，在4℃下離心5分鐘，小心地棄去上清液，用冰冷的70％乙醇洗沉澱，離心5分鐘並小心地棄去上清液，真空抽乾沉澱，並用TE緩衝液重新溶解沉澱。
2.延伸和終止反應 以利用T7DNA聚合酶進行的雙脫氧鏈終止反應為例。
(1) 材料 變性的雙鏈DNA模板(溶解在TE緩衝液中)，0.5pmol/?L寡核苷酸引物(溶解在TE中，-20℃貯存)，5×測序緩衝液(200mmol/L Tris pH7.5，50mmol/L MgCl2，-20℃貯存)，0.1mol/l DTT(當月新配-20℃貯存)，15pmol/L的3種dNTP混合物(缺dATP)，1 000至1 500Ci/mmol ?32p dATP(在－20℃下達4至6周)，修飾的T7 DNA聚合酶，標準酶稀釋溶液(20mmol/L Tris－HCl pH7.5，0.5mg/mlBSA，10mmol/L ?- 巰基乙醇，4℃貯存)，終止混合物(表2-30)，甲醯胺上樣緩衝液(0.2ml 0.5mol/LEDTA pH8.0，10mg溴酚藍，10mg二甲苯青，10ml甲醯胺)。
表2-30 T7DNA聚合酶終止反應混合物
反應成分 ddG ddA ddT ddC 最終濃度
H2O 15 15 15 15 －
5×測序緩衝液 6 6 6 6 － 1mmol/L
4dNTP 6 6 6 6 200μmol/L
1mmol/L ddGTP 3 － － － 20μmol/L
1mmol/L ddATP － 3 － － 20μmol/L
1mmol/L ddTTP － － 3 － 20μmol/L
1mmol/L ddCTP － － － 3 20μmol/L
(2) 配製方法
① 取4支0.5?l小離心管，標上G、A、T、C，每管加入7?l變性的雙鏈DNA模板(分別為1和2?g)，1?l寡核苷酸引物和2?l 5×測序緩衝液混合，65℃保溫2分鐘，在室溫下冷卻30分鐘。
② 每管加入1?l 0.1mol/L DTT，2?l 1.5mol/L 3種dNTP混合物，0.5?l ?32P dATP和2?l(2IU)修飾的T7DNA多聚酶混合物，在室溫下放置5分鐘。
③ 按標記每管分別加入3?l 4種ddNTP終止混合物的一種。
④ 短促離心後，在37℃下保溫5分鐘。
⑤ 加入5ml甲醯胺上樣緩衝液，上樣前在80℃下加熱2分鐘，並迅速置於冰浴上，每個樣品取3?l，上樣電泳。
3.測序反應物電泳和序列讀取
(1) 按普通聚丙烯醯胺凝膠製作方法製作梯度膠。
(2) 按G、A、T、C次序加入每種樣品，在G、A和T各泳道上樣1ml，而在C泳道上樣1.5?l。
(3) 上樣完畢加壓1700V電泳，根據樣品中溴酚藍和二甲苯青染料遷移情況確定電泳時間。
(4) 電泳完畢，在10℃冰醋酸中漂洗30分鐘脫去尿素。
(5) 在60℃或80℃乾燥30分鐘後，放射自顯影讀取序列。
