嵌合病毒的出現
嵌合病毒與DNA病毒相比，RNA病毒的研究進展還是緩慢得多，原因在於(十)RNA病毒複製方式是RNA—RNA，沒有DNA中間體，所以無法直接對其進行基因水平上的操作，也就無法對基因功能進行研究。感染性克隆是一項針對RNA病毒研究的技術，其原理是將病毒基因組RNA逆轉錄成cDNA分子並進行克隆，然後將cDNA克隆再次通過體外轉錄成為RNA分子，轉染細胞後，由於RNA有感染性可以重新獲得病毒，這樣人為地加入了cDNA環節，使在RNA病毒基因水平上的操作成為可能。
從1981年利用該技術重新獲得7．5kb的脊灰病毒開始，許多RNA病毒的全長感染性克隆相繼獲得，到200o年，RNA病毒中最長的冠狀病毒(27kb)也製備出相應的克隆。對於基因全長為llkb的黃熱病毒屬成員來講，製備出全基因組cDNA克隆已經不是難事，接下來的工作是如何利用它們進行分子機制研究，實現疫苗、病毒載體、藥物的開發等。構建嵌合病毒是其中一條重要的解決途徑。嵌合病毒是利用一些已知特性的病毒株作為受體l引，以另一個病毒株作為供體提供結構蛋白基因，替換掉受體株的相應位置的基因，供體株的結構蛋白基因包含和中和抗性、細胞接觸融合、內化作用、血凝作用等有關的抗原決定簇，這樣產生的嵌合病毒的生物特性由兩者共同決定。
RNA嵌合病毒可以用於病毒複製能力、毒力、減毒機制等基礎研究，因為嵌合病毒的複製特性主要由受體株的非結構蛋白以及非編碼區決定，而供體株的結構區基因和特異的免疫原性有關，通過比較不同供體的基因，結合生物特性的改變，可以了解結構基因的功能，目前多用於尋找病毒的毒力相關位點、抗原決定簇等。嵌合病毒也可用於RNA病毒疫苗的研製，其主要原理是利用穩定的減毒株作為受體株，嵌合進供體株相應的結構基因，這樣得到的嵌合病毒株既保留有一定的減毒特性，還能針對供體株具有免疫性。嵌合病毒疫苗株屬於減毒活疫苗，和亞單位疫苗、滅活疫苗、DNA疫苗等相比更為有效：因為活疫苗能夠在宿主體內有效複製，與自然感染一樣產生一系列不同形式的抗原，誘導細胞因子和免疫反應的產生；細胞內複製能產生很強的CTLs反應和有長效記憶功能的T細胞，免疫力持久而有效。減毒活疫苗的獲得有多種方式，傳統的方法是利用病毒株的生物特性，如噬菌斑的大小、中和抗體的結合能力、溫度敏感性、-q細胞受體結合程度等對病毒株進行篩選，通過細胞傳代的方法獲得減毒株；通過這些方法確實篩選到了一些病毒的減毒株．如麻疹、流行性腮腺炎、風疹、脊髓灰質炎等RNA病毒，黃熱病毒屬中的JEV、YFV等，都具有很好的預防效果但這項工作隨機性很大，耗時很長，不少實驗室經過了多年的工作最後卻不得不放棄。嵌合病毒的出現大大加速了減毒活疫苗的研製進程，其目的性強、可控性好、操作快、周期短；另外嵌合病毒以感染性克隆的形式作為種子批保存，可減少生產批次間的差異，保持疫苗的安全性和穩定性，所以嵌合病毒有望成為RNA病毒第三代疫苗的主力軍。
載體的選擇
嵌合病毒嵌合病毒是一種基因工程重組病毒，在製備技術上並不存在太大問題，但作為重組病毒，在安全性上還有一定的風險，在自然條件下，有病毒之間自發產生重組的例子，可能獲得一些意想不到的新型病毒，比母體株毒力更強，對生物體更具有威脅性。所以在製備嵌合病毒時，要採用已知特性的病毒株作為嵌合病毒的骨架結構，特別是多選用減毒株作為載體病毒目前黃熱病毒的嵌合病毒採用的載體主要有以下幾種。
YF一17DD 疫苗株
YF一17DD是目前預防黃熱病毒感染的一株減毒活疫苗】，始用於1936年，在過去的6O多年中，有超過3億人接種過該疫苗，安全有效。該疫苗株免疫原性很好，單劑量接種後10d內，近lo0％的接種者產生中和抗體，免疫力持久甚至能夠維持終身。將YF一17DD疫苗株和原病毒株YF—Asibi進行序列比較後發現，該病毒的抗原表位多集中在E基因，構建嵌合病毒多以這一段基因作為靶基因。這樣構建的嵌合病毒中，由YF一17DD株保留的NS蛋白基因只是誘發針對該蛋白的CTLs和非中和性抗體，而不具有交叉保護性，所以嵌合病毒作為疫苗使用時不會引起一般重組病毒帶來的抗載體免疫反應，即使曾經接種過YF一17DD的接痘者再接種嵌合病毒也是安全有效的，可以作為一個理想的活疫苗株嵌合病毒載體。1989年Rice等151構建了YF一17DD的感染性克隆，為構建嵌合病毒提供了方便，目前文獻中報導的有關黃熱病毒嵌合株多以此病毒株作為載體病毒。已經成功構建了包括JEV、TBE、WNV、DEN等4個血清型病毒的嵌合體。
DEN一4變異株
登革病毒分為4個血清型，這4型病毒結構蛋白胺基酸序列同源性高達62％-74％，並且它們之間還有很好的交叉免疫原性，一直以來，人們試圖構建登革病毒的4價疫苗，Bray等從1991年開始登革病毒嵌合病毒的研究，以DEN一4814669株全長克隆作為載體，構建了包括DEN—l到DEN一3的嵌合病毒，結果發現幾株病毒的毒性並沒有太大改變，他們認為若能夠以一個毒性低的DEN-4病毒作為載體骨架，可能會使嵌合病毒毒性下降，由於3端和5端非編碼區在病毒的複製中可能也起到調控作用，他們在構建的DEN一4感染性克隆的基礎上，刪除其3端和5端非編碼區的部分序列，結果篩選到一株減毒株，其3端去掉了3O個核苷酸，毒性降低但是免疫原性並沒有改變。用這個減毒株作為載體和其它3個血清型的登革病毒構成嵌合病毒後，果然有效地降低了病毒毒性；其後這個載體也用於構建黃熱病毒屬其他成員的嵌合病毒。
DEN一2 PDK一53減毒株
該減毒株也主要是用於合成登革病毒的嵌合疫苗，2O世紀8O年代初期，泰國Mahidol實驗室將4種血清型的登革病毒經過在細胞傳代中後獲得各自的減毒株，其中以DEN一2PDK一53減毒株減毒效果最好，免疫保護力最強最持久。將該減毒株和野生株進行比較，發現核苷酸水平上的變異主要在非結構區，說明該病毒株和毒力有關的基因可能在非結構區，而黃熱病毒屬其他成員的毒力基因多位於E蛋白，這樣構建的嵌合病毒減毒機制主要由供體株的毒性起主要因素，而由DEN一2PDK-53減毒株構建的嵌合疫苗毒性的減弱由供體和受體共同決定，更有利於減毒株的獲得
DEN一2減毒株作為嵌合病毒的載體還有另外一個好處，登革病毒4個血清型之間產生交叉免疫力，所以異型病毒的二次感染由於抗體依賴的增強作用可以導致登革出血熱／登革熱休克綜合徵(DHF／DSS)的發生，理想的登革4價疫苗誘導的免疫力要針對4種血清型病毒，有效而且要持久，其中任何一種血清型抗體的消減都有發生DHF／DSS的可能。流行病學資料表明，DEN幾個血清型感染人的機率是不同的，其中以DEN一2的感染機率最高，所以由其它幾種血清型病毒誘發的免疫反應很易識別DEN一2病毒，由此DEN一2病毒誘發DHF／DSS的機率明顯大於DEN—l、一3、一4；另外DEN一2病毒誘導的特異免疫力又明顯弱於其它3型，所以製備以DEN一2為基礎的4價疫苗和傳統疫苗比較，減少了DEN—l、一3、一4的4種血清型NS3蛋白誘發的交叉免疫反應之間的干擾作用，減少了DHF／DSS的可能，同時又能有效而持久地誘導機體產生針對4種血清型的免疫反應，從而起到預防作用。
技術路線
克隆法
嵌合病毒的獲得大多是利用感染性克隆技術，目前已有部分黃熱病毒屬病毒獲得了感染性克隆，如YFV、TBEV、Kunjin病毒、墨累河谷腦炎病毒(MVE)、西尼羅河病毒(WNV)、DEN4型病毒，這些克隆包含有病毒的全部基因，能夠在宿主菌中穩定地複製和傳代，以作為種子批保存。當構建嵌合體時，在供體基因和受體基因的連線處，通過同義突變或者保守突變，為受體株和供體株基因組添加合適的酶切位點，然後將兩者利用酶切位點連線起來，製備嵌合性克隆，體外經RNA聚合酶作用轉錄出嵌合性轉錄子，轉染細胞後重新獲得嵌合病毒。這項技術的一個優點在於在它是在cDNA水平上的操作，突變率低、表型穩定，不像傳統疫苗研製過程中容易發生一系列的生物特性改變。
融合PCR
利用PCR技術製備嵌合病毒最大的優點在於方便快捷，過去幾個月的工作現在幾天就能完成。目前生物技術產品日臻完善，不少公司推出高保真、熱穩定性好的逆轉錄酶和DNA聚合酶，如SuperscriptII逆轉錄酶、LAro~酶、Exraq酶、ExpandlongtemplatePCR聚合酶系統等，利用這些酶可以有效地擴增出病毒基因組大片段(>5kh)甚至全長的cDNA。用4條引物、3次PCR可以把兩個異質基因片段連線在一起。另有報導利用3個引物、兩次PCR即可製備嵌合基因，如YF—MOD嵌合病毒。
與克隆技術相比較，PCR方法更為靈活，可以選擇任意位置進行嵌合；但是PCR具有一定的突變率，可能會帶來一些致死性突變而使轉錄體不具有感染性，得不到恢復病毒從而前功盡棄，所以現在大多數實驗還是採取克隆法。
滅活病毒之間的基因重組
是將兩種或者兩種以上的滅活病毒，在同一細胞內培養後，它們之間發生基因重組，有時會產生感染性病毒，這種方法又稱為多重複合，可能由於滅活病毒受損的基因經重組後得以替補。如為了解包膜病毒的融合活性，利用黃熱病毒YF一17DD和流感病毒X31兩者不同的融合條件，以及核衣殼不同的形態，將YF一17DD通過酸處理失去融合活性，X31通過熱處理滅活，兩者在YF一17DD滅活的同一pH值下發生融和反應，只有發生融和反應的嵌合病毒具有感染性；流感病毒提供功能型膜蛋白融合成分，YF一17DD提供功能基因組，結果兩個滅活病毒又重新構建成新的病毒。這項技術隨機性很大，但是可能得到意想不到的結果，可以用於病毒功能的研究。
形式及影響因素
黃熱病毒嵌合病毒的構建前提在於，所有的黃熱病毒的病毒基因組的結構是高度保守的，它們均為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約l1kb，5端有帽子結構，3端無poly(A)尾，一個長的開放閱讀框架覆蓋了大部分基因組，共編碼3個結構蛋白和7個非結構蛋白，其中以E蛋白和免疫原性關係最為密切，所以構建的嵌合病毒一般都要取供體病毒的E基因；但並不是所有構建的嵌合性cDNA克隆都具有感染性，其主要影響因素如下。
技術方面
雖然現在工具酶的保真性和效率越來越好，但是黃熱病毒長10kb以上，在基因操作中不可避免有突變的發生，而有些突變是致死性突變，使得構建的全長cDNA克隆或者嵌合體克隆沒有感染性。另外這些突變還影響恢復病毒的生物學特性，如溫度敏感性、噬斑大小、複製能力、嗜細胞能力都可能發生改變。
嵌合位點
結構蛋白基因之間的連線處有一段親脂區序列，是構建嵌合病毒時將兩段異質核苷酸序列進行連線的嵌合位點處，這一段序列的保守性對於嵌合病毒的複製能力至關重要。如在prM和C基因之間有信號肽酶切割位點以及蛋白酶切割位點，Cau—four等在構建YF17D—DEN2嵌合病毒時選擇這兩處作為嵌合位點，結果在信號肽酶切割位點處嵌合的病毒有感染性，而在蛋白酶切割位點處進行連線無法獲得病毒，因為在兩個位點之間有一段親脂性的轉膜區，YFv這一區域比DEN一2該區域要多6個胺基酸；在蛋白酶切割位點處構建的嵌合體，由於這一轉膜區缺少了6個胺基酸，蛋白酶和信號肽酶不能正確識別切割位點，從而影響prM蛋白和E蛋白的成熟，病毒的複製過程受到阻礙，病毒顆粒沒法進行正常的包裝，所以無法分泌出病毒顆粒。
供體病毒基因
目前構建的嵌合病毒多為供體株提供P和E基因，人們也嘗試過替代C基因或者部分基因，但多數沒有成功，其可能的原因是位於C蛋白區域的保守序列與受體株病毒順式結構不相容性，進而對嵌合病毒RNA的複製產生了毒性，如Kuniin病毒RNA複製必須有同源C蛋白上的第2位和第20位胺基酸的存，而異質基因的C蛋白不能協助Kunjin病毒複製，所以無法長成病毒顆粒；另外也可能是異質病毒之間的蛋白酶識別對方序列的能力低下，對於C—prM部位的切割效率低，影響病毒正常的裝配和釋放能力。
受體病毒基因
作為嵌合病毒載體，嵌合病毒中的大部分基因由受體株提供，嵌合病毒的複製特性也主要由受體株的基因控制，其中有些序列對於嵌合體的感染性有決定性作用，在構建嵌合體時，如果這部分序列受到破壞，就不能夠獲得恢復病毒。如在構建DEN一4和WNV的嵌合病毒時㈣，由WNVNY99的prM和E基因代替DEN一4相應位置的基因，在構建的18個克隆中僅有兩個具有感染性，序列比較發現這兩個克隆在prM和C蛋白之間的NS2A—NS2B蛋白酶切割位點下游，在轉膜信號區域中都包含一基序，這一基序是酶切割位點下游的第3位及第6位分別為天冬氨酸和蘇氨酸，另外16個克隆則沒有該位點，實驗表明這兩個位點似乎和嵌合性克隆的感染性有關。
特性
嵌合病毒的一個最大特點是表型多發生變化，如複製能力、毒力、抗原性等，可能的原因是由於缺乏校正功能的聚合酶存在，而有異質基因的正鏈RNA病毒，在病毒複製中具有較高的基因突變率，並且這些突變為了適應不同的宿主細胞，可能會發生一些特性改變，從而出現一些預想不到的結果。
生長特性改變
嵌合病毒的兩個母體病毒的易感細胞不同，得到的嵌合病毒在不同細胞中複製時，由於缺乏有效的複製酶而引起生長特性的改變，其嗜細胞性也會有所改變，另外噬斑試驗中噬斑形態
大小都多有變化。如Chimeri—JE嵌合體在Vero、LLC—MK，、C6／36細胞中複製形式類似，而在MRC一5、FRhl細胞中雖然病毒滴度能夠達到6log。0pfu／mL，但是卻不能產生CPE，這些特性和母體株YFV以及JEV都截然不同。LGT1和E5是TBEV的兩個弱毒株，與DEN一4病毒組成的嵌合體在猿猴細胞中複製能力下降，而轉染蚊蟲細胞複製能力不受影響，用在蚊蟲細胞傳代的嵌合病毒在猿猴細胞LLC—MK2中不能夠形成噬斑，而在早期構建的DEN一4和另一個TBEV病毒株構建的嵌合體在猿猴細胞中卻能夠得到比DEN一4病毒滴度高1000倍的嵌合病毒。
神經內毒性和神經外毒性
神經內(外)毒性低而免疫原性好是一個理想疫苗應具備的品質，許多實驗室經過多年研究雖然篩檢出一些減毒株，但是兩者多不能達到有效的統一。嵌合病毒技術以“取長補短”的原則，將兩種病毒的免疫原性和毒性結合起來，以期研製理想疫苗，就目前得到的一些嵌合株來說，確實取得了一些令人滿意的結果，如DEN一4和WNV的嵌合病毒與WNV相比高度減毒㈣，腦內接種戒奶小鼠，神經內毒性降低至1／28500；腹腔內接種小鼠，神經外毒性下降至1／10000，免疫原性好，能安全保護小鼠接受野生株攻擊。另外如ChimeriVax—JE嵌合病毒毒性也較母體株YFV和JEV呈大幅度下降，而單劑量又具備很好的免疫保護力；還有DEN—TBEV、YFV-DEN、YFV—WNV等嵌合病毒株的毒性都有所下降，這些嵌合體都在進一步的研究中。
基因穩定性
因為RNA病毒易以準種的形式出現和易變異的特性，作為活疫苗來使用，一個重要的條件是基因型要穩定，這一點是疫苗安全性的重要表現。嵌合病毒的穩定性主要通過返祖實驗檢定，即在乳鼠腦內和細胞中進行培養，觀察有無明顯表型變化，必要時進行核苷酸鑑定，如ChimeriVax-JE嵌合病毒115．161在細胞內傳代l8次以及在乳鼠腦內傳代6次並沒有毒力的回升，對減毒位點進行測序也沒有發生核苷酸改變。而有的嵌合病毒穩定性不夠好如DEN一2／DEN一4、DEN一2／DEN—l複製能力較弱，而經過幾次傳代後得到較高的病毒滴度，是因為發生了一些突變。在體外轉錄時產生了轉錄體的雜和體，在轉染後經過細胞複製，複製能力增強的病毒逐漸占主要優勢，在LLC—MK2細胞中病毒傳代可以保持較高的遺傳穩定性，所以在製備嵌合疫苗時，應儘量減少病毒在哺乳動物細胞中傳代的次數。
套用前景
在黃熱病毒嵌合病毒發展的這十幾年中，人們嘗試構建了多種嵌合病毒，其中大部分是以製備疫苗為目的，另外還用於病毒的分子生物學特性研究。
分子生物學特性研究
型內嵌合病毒可以用於了解病毒複製能力，進一步了解各基因的功能。如構建同型不同株之間DEN一216681／PDK一53、DEN25ol／04株之間的型內嵌合疫苗，研究DEN一2型病毒結構蛋白區對乳鼠神經毒性的影響。可以用於推測病毒毒力位點，由2個JEV病毒株cDNA克隆提供5端，3個病毒株cDNA提供的3端進行組合，感染細胞後重新獲得6種重組JEV病毒。根據噬菌斑大小篩選到3個減毒株，比較6種重組病毒株和野生株的基因序列，發現僅僅是E138(Glu—Lys)一個胺基酸位點不同，說明這個位點和毒力之間關係密切；另外發現該突變株雖然毒性降低，但是腦內注射接種小鼠後仍能在腦內複製，但是病毒滴度比較低，看來其減毒機制不在於病毒的複製，而可能是影響複製的早期機制，在細胞之間傳遞速度比較慢，從而使免疫系統能及時清除病毒。
型間嵌合病毒也可以用於分子生物學特性的研究，如黃熱病毒和日本腦炎病毒雖然同屬黃熱病毒屬，但是有很多生物學特性都不盡相同，如抗原性相差很遠、中間宿主不同、引起人體發病的症狀也截然不同；兩者雖然從同一病毒得來，但是在進化的過程中發生了很大的變化，構建的嵌合病毒YF／JE(S)其生物學特性也有所改變，如神經內毒性和神經外毒性都有所降低，和其供體株SAl4一l4—2相似；而構建的另一個嵌合株YF／JE(N)神經毒性卻很高，和供體株Nakayama特性一致；這說明確實如原先預料，和減毒有關的表位主要存在E蛋白中，而同時也發現，和原來的SA14-14-2相比較，嵌合株在細胞中複製能力升高，病毒滴度較高，免疫原性增加，這又說明是YF一17DD病毒的非結構蛋白發揮作用。
候選疫苗
ChimeriVax-JE嵌合病毒
日本腦炎是一種影響中樞神經系統的疾病，主要流行於亞洲，但是近年在澳洲、美洲也有病例發生，每年官方報導全球有5萬病例，其中有l萬例是致死性的；雖然目前有活疫苗、滅活疫苗的使用，但是這些疫苗具有免疫原性不夠、價格偏高、製作工藝不被WHO認可等劣勢，所以還有必要開發研製新疫苗。1999年Chambers等以SA14-14-2的prM和E基因代替YF一17DD疫苗株的相應基因構建了嵌合病毒ChimeriVax—JE[15,16,，該病毒能在WHO認可的細胞中很好地被培養，恢復病毒和YF一17DD、SA14—14-2相比較，以6log0pfu的嵌合病毒腦內接種3-4周齡小鼠無一例發病，而接種YF-17DD的小鼠全部死亡；另外用3．2log0pfu劑量的SA14-14-2接種，能在85％一95％的接種者中產生中和抗體，抗體平均滴度能夠達到PRNT~o<30，血清陽轉率小於80％；而接種4~51og0pfu的嵌合疫苗後，能夠達到100％的血清陽轉率，接種後30dPRNT能夠達到129~327，這些結果表明構建的嵌合病毒神經內毒性呈大幅度降低；用乳鼠以及猴子進行安全試驗檢測，進一步證實了該病毒的弱神經毒性，內臟毒性也下降。目前該疫苗已經通過一期臨床試驗，是很有前途的疫苗候選株。
登革病毒多價疫苗
登革病毒是目前誘發疾病最多的黃熱病毒，在人口聚集的熱帶及亞熱帶時有爆發，因為登革病毒4個血清型之間可以產生交叉保護力，所以感染一種病毒後，能夠對另外3種血清型病毒的抗體反應。在機體遭受另一種血清型病毒的感染後，由於抗體依賴的複製能力增強作用可能誘發DHF／DSS的發生，因此理想的疫苗應該能夠產生針對4個型病毒的中和抗體和T細胞免疫。目前主要有兩個實驗室分別以DEN一2PDK一53和YF一17DD作為受體株構建了包括DEN一1到DEN-4型的嵌合株，結果有很好的免疫原性、較高的複製效率和穩定性，在動物實驗中證明毒性減低，小鼠效力實驗安全有效，有望成為登革病毒疫苗的發展方向。
另外還有YF／TBE、YF／WNV、DEN4／TBE的報導，都出現一些令人滿意的特性，進一步研究正在進行中。嵌合病毒的出現是獲得減毒活疫苗的一個新途徑，和傳統方法相比具有目標明確、免疫效果好、減毒穩定的優勢，但該技術目前還處於探索階段，有時結果很出人意料，所以在構建一個新的嵌合體時，要時刻注意安全性問題，否則會適得其反，創造出新的毒性更強的病毒，為人類帶來危害。
疫苗
嵌合疫苗是套用基因工程手段構建基因能表達兩種以上病原體抗原的一類新型疫苗,套用嵌合疫苗可解決多次接種問題。本文綜述了目前世界一些國家研製的嵌合疫苗,如登革病毒、乙型腦炎病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人類免疫缺陷病病毒及人乳頭瘤病毒等相關嵌合疫苗的研究策略和方法、免疫學評價及其套用前景。盤點最可怕的生化武器
| 我們的世界中存在很多知名的細菌、真菌和病毒。生化戰爭也就是利用它們摧毀敵人。20世紀上半葉，德國和日本使用了生化武器：炭疽膿皰。美國、英國和俄羅斯也紛紛開始了生化武器的研發。今天，根據1972年的生化武器公約和日內瓦議定，生化武器被禁用。然而即使一些國家早已銷毀了庫存的生化武器，並停止了研究，但威脅依然存在。 |
