簡介
層蛋粘連白對體外角膜上皮細胞凋亡的保護
經驗交流
觀察層粘連蛋白（LN）對離體角膜上皮細胞存亡的影響，以尋找預防角膜上皮細胞凋亡的途徑。方法套用流式細胞儀(FACStarplus)檢測凋亡細胞的亞2倍體DNA的方法，對基礎培養的、與LN共育的以及阻斷LN受體後的兔角膜上皮細胞的凋亡情況進行了對比觀察及分析。結果基礎培養的第6代角膜上皮細胞出現明顯的細胞凋亡；與LN共育的角膜上皮細胞凋亡不明顯；阻斷LN受體後，角膜上皮細胞出現顯著的凋亡現象。結論LN對離體培養的角膜上皮細胞的凋亡有保護作用。
利用培養的角膜上皮行角膜移植以改善眼表，是治療角膜表面疾患的新嘗試。體外能獲得長期存活並增殖的角膜上皮細胞是此方法實施的前提，可是在我們對角膜緣上皮細胞進行離體培養時，歷經幾次細胞傳代培養，上皮細胞的增殖力逐漸減弱，最後停止增殖而死亡。為探索細胞死亡的原因，我們套用基礎培養、與層粘連蛋白(laminin，LN)共育以及阻斷LN受體法，對離體角膜緣上皮細胞的存活情況進行了觀察及對比分析，以尋找預防細胞凋亡的途徑。
具體過程
1 材料與方法
1．1 角膜上皮細胞培養法
1．1．1 基礎培養法 取新鮮兔眼球，無菌處理後，取淺層帶有角膜上皮的角膜緣組織，以質量濃度0.25%胰蛋白酶－0.01mol／L EDTA孵育消化法獲取角膜上皮細胞(1×106／ml)，在含有10%小牛血清的F12－DMEM（Gibco，USA)培養液中，5%CO2，37℃，飽和濕度培養箱中培養。48h傳代1次。
1．1．2 與LN共育法 將96孔培養板底塗一層LN液(25μg／cm2)，－70℃凍乾後，將角膜上皮細胞(1×106／ml)種於上。5%CO2，37℃，飽和濕度培養箱中培養48h。
1．1．3 阻斷LN受體法 將角膜上皮細胞種植在含有10μg／ml抗－LN單克隆抗(Sigma，USA）培養液中，5%CO2，37℃，培養48h。
1．2 細胞凋亡的流式細胞儀檢測法
用質量濃度0.25%胰蛋白酶、0.01mol／L EDTA消化培養48h後的各組角膜上皮細胞，收集細胞，調細胞濃度在1×106個／ml；取1ml細胞懸液，離心800～1000r／min，10min，棄上清；重懸細胞於100μl的PBS中；慢慢滴注細胞懸液到(事先預冷－20℃)5ml的70%的乙醇中固定；放置4℃中待用。用前離心去除固定液；加PNAase 200μl37℃水浴30min；再加入800μl碘化丙啶(prooidium iodide，PI)染色液，混勻，4℃，避光30min；在FACStarplus流式細胞儀上分析細胞凋亡(亞2倍體DNA)的情況。實驗獲取的數據經SPSS 4.0統計學軟體處理分析。
2 結果與分析2．1 離體角膜上皮細胞在基礎條件培養下的細胞凋亡檢測結果 角膜原代上皮細胞被檢測出7.00%±2.23%的凋亡細胞。第1代到第5代各組細胞與原代相比，細胞凋亡率並無明顯變化(P＞0.01)；從第6代開始，角膜上皮細胞凋亡率為18.74%±3.93%，與原代相比，細胞凋亡率有顯著升高(P＜0.01)。
2．2 與LN共育的第6代角膜上皮細胞凋亡率明顯低於基礎條件培養下的同代細胞(P＜0.01)，見表1。
表1 LN對離體培養的角膜上皮細胞
表1 LN對離體培養的角膜上皮細胞
凋亡率的影響(±s，n＝5)
Tab．1 The effect of laminin on the apoptosis rate of corneal
epithelial cells cultured in vitro(±s，n＝5)
阻斷LN受體後，角膜上皮細胞貼壁障礙，原代細胞即被檢測出30.80%±7.90%的凋亡DNA。見表2。
表2 阻斷LN受體對離體培養的角膜上皮細胞
Tab．1 The effect of anti-laminin receptors on the apoptosis rate
of corneal epithelial cells cultured in vitro(±s，n＝5)
Apoptosis rate（％）tP
Passage 0 （control）6.3±1.7
Passage 0 in anti-LN30.8±7.96.77960.0019
ttest P＜0.01
3 討論細胞凋亡是一個非常複雜的生理和病理過程，機體內外多種因素均可影響細胞凋亡的發生［1］。角膜上皮組織在生理狀況下存在著一定數量細胞凋亡，所丟失的細胞由角膜緣幹細胞的增殖來補充，維持著角膜上皮的完整［2］。角膜緣幹細胞在理論上應該是具有無限潛在的增殖能力，可是在我們對角膜緣上皮細胞進行體外培養時，發現在一般培養條件下，第6代角膜緣上皮細胞出現了顯著的細胞凋亡現象，不足10代時，細胞出現了集體“自殺”現象。這與角膜緣上皮細胞在體內的代謝情況相差甚遠，這種離體後細胞的凋亡無疑與體外細胞生長環境的改變相關。
LN是基底膜的特異的和主要的蛋白組成成分，它突出的生物作用就是促進細胞的粘附和運動。近年來，發現LN生物效應遠比目前定義的要複雜得多，雖然現在還不能很明確地定義LN的功能，但是許多研究的確發現LN與眾多的細胞生物現象相關［3］。多年來，在治療角膜上皮疾患中發現：長期不愈的角膜上皮缺損都伴有角膜基底膜的異常及缺失［4］。基底膜中的LN除了促進細胞粘附的重要功能之外，它的成分及空間結構決定著角膜上皮的分裂、增殖及分化［5］。因而，LN應是與上皮細胞存活最為密切的相關因素之一。我們用抗LN抗體完全封閉內源及外源性LN對離體的角膜上皮的作用時發現細胞貼壁障礙，幾乎不增殖，原代細胞就出現大量的細胞凋亡，由此可見LN的缺乏可誘導細胞凋亡的發生。相反，我們用外源性LN來增進培養細胞的粘附及增殖可明顯地減少細胞的凋亡。因此，在預防角膜上皮細胞凋亡的措施中，LN應是不可缺少的重要因素之一。
