基本概念
southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經限制性內切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性並在原位將單鏈DNA片段轉移至尼龍膜或其他固相支持物上，經乾烤或者紫外線照射固定，再與相對應結構的標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。
發明者
埃德溫•邁勒•薩瑟恩Southern雜交是由英國牛津大學著名生物化學家埃德溫•邁勒•薩瑟恩(Edwin Mellor Southern)爵士於1975年在愛丁堡大學任職時發明的，因這項發明他獲得了2005年度的拉斯克臨床醫學研究獎。
原理
Southern印跡雜交技術是分子生物學領域中最常用的具體方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按鹼基互補的原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。由於核酸分子的高度特異性及檢測方法的靈敏性，綜合凝膠電泳和核酸內切限制酶分析的結果，便可繪製出DNA分子的限制圖譜。但為了進一步構建出DNA分子的遺傳圖，或進行目的基因序列的測定以滿足基因克隆的特殊要求，還必須掌握DNA分子中基因編碼區的大小和位置。有關這類數據資料可套用Southern印跡雜交技術獲得。
Southern印跡雜交技術包括兩個主要過程：一是將待測定核酸分子通過一定的方法轉移並結合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）；二是固定於膜上的核酸同位素標記的探針在一定的溫度和離子強度下退火，即分子雜交過程。該技術是1975年英國愛丁堡大學的E.M.Southern首創的，Southern印跡雜交故因此而得名。
早期的Southern印跡是將凝膠中的DNA變性後，經毛細管的虹吸作用，轉移到硝酸纖維膜上。印跡方法如電轉法、真空轉移法；濾膜發展了尼龍膜、化學活化膜（如APT、ABM纖維素膜）等。利用Southern印跡法可進行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長度多態性分析（RFLP）等。
試驗方法
雜交總流程基因組DNA的酶解
根據實驗目的決定酶切DNA的量。一般Southern雜交每一個電泳通道需要10-30μgDNA。為保證消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA濃度不宜太高，以0.5μg /μL 為
酶切後的基因組DNA電泳圖好。
在最適溫度下消化1-3h，消化結束時可取5μL電泳檢測消化效果。如果消化效果不好，可以延長消化時間，但勿超過6h。也可通過放大反應體積或補充酶再消化來解決。如仍不能奏效，可能的原因是DNA樣品中有太多的雜質，或酶的活力下降。
消化後的DNA加入1/10 體積的0.5mol/L EDTA，以終止消化。然後用等體積酚抽提、等體積氯仿抽提，2.5倍體積乙醇沉澱，12000g以上高速離心，收集DNA片段，用TE緩衝液溶解。
如果需要兩種酶消化DNA，而兩種酶的反應條件可以一致，則兩種酶可同時進行消化；如果反應條件不一致，則先用需要低離子強度的酶消化，然後補加鹽類等物質調高反應體系的離子強度，再加第二種酶進行消化。也可在使用第一個酶消化結束後，使用上述方法先分離純化後，再建立新的酶切反應體系，進行第二個酶的酶切，這種方法優點在於可以避免兩個酶之間的干擾，缺點在於會損失一部分DNA片段。
基因組DNA消化產物的瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳是目前分離核酸片段最常用的方法，製備簡單，分離範圍廣可從200bp到50kb，實驗成本低。
1. 製備瓊脂糖凝膠：一般用於Southern雜交的瓊脂糖凝膠濃度為0.8%。
2. 電泳：電泳樣品中加入上樣緩衝液，混勻後上樣，留一或兩泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA從負極泳向正極。電泳至溴酚藍指示劑接近凝膠另一端時，停止電泳。取出凝膠，紫外燈下觀察電泳效果。在膠的一邊放置一把刻度尺，拍攝照片。正常電泳圖譜呈現一連續的塗抹帶，照片攝入刻度尺是為了以後判斷信號帶的位置，以確定被雜交的DNA長度。
DNA從瓊脂糖凝膠轉移到固相支持物
轉移就是將瓊脂糖凝膠中的DNA 轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）或尼龍膜上，形成固相DNA。轉移的目的是使固相DNA與液相的探針進行雜交。常用的轉移方法有鹽橋法、真空法和電轉移
DNA的轉膜法。這裡介紹經典的鹽橋法（又稱為毛細管法）。
（一）試劑準備
１．變性液：0.5mol/L NaOH；1.5mol/L NaCl。
２．中和液：1mol/LTris-HCl(pH 7.4)；1.5mol/LNaCl。
３．轉移液（20×SSC）： NaCl 175.3g；檸檬酸三鈉82.2g，NaOH 調pH 至7.0，加雙蒸水定容至1000mL。
（二）操作步驟
1.鹼變性 室溫下將凝膠浸入數倍體積的變性液中30min。
2.中和 將凝膠轉移到中和液15min。
3.轉移 按凝膠的大小剪裁NC膜或尼龍膜並剪去一角作為標記，水浸濕後，浸入轉移液中5min。剪一張比膜稍寬的長條Whatman 3mm濾紙作為鹽橋，再按凝膠的尺寸剪3-5張濾紙和大量的紙巾備用。轉移過程需要大概8-24h，每隔數小時換掉已經濕掉的紙巾。轉移液用20× SSC。注意在膜與膠之間不能有氣泡。整個操作過程中要防止膜上沾染其他污物。
4. 轉移結束後取出NC膜，浸入6×SSC溶液數分鐘，洗去膜上沾染的凝膠顆粒，置於兩張濾紙之間，80℃烘2h，然後將NC膜夾在兩層濾紙間，保存於乾燥處。
特別注意的是印跡操作時須戴手套作業，以免污染尼龍膜而影響DNA的固定。
探針標記
進行Southern 雜交的探針一般用放射性物質標記或用地高辛標記。放射性標記靈敏度高，效果好；地高辛標記沒有半衰期，安全性好。以下以放射性標記為例。
探針的標記方法有隨機引物法、切口平移法和末端標記法。
以下為隨機引物試劑盒提供的標記步驟：
1．取25-50ng模板DNA於0.5mL離心管中，100℃變性5min，立即置冰浴。
2．在另一個0.5mL離心管中加入：
Labeling 5×buffer 10μL （含有隨機引物）
dNTPmix 2μL (含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mmol/L)
BSA（小牛血清白蛋白） 2μL
[a-P]datp 3μL
Klenow酶 5U
3．將變性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μL，混勻。室溫或37℃ 1h。
4．加50μL終止緩衝液終止反應。
標記後的探針可以直接使用或過柱純化後使用。由於a-P的半衰期只有14天，所以標記好的探針應儘快使用。探針的比活性最好大於10計數/分/μL。
雜交
Southern 雜交一般採取的是液-固雜交方式，即探針為液相，被雜交DNA為固相。雜交發生於一定條件的雜交液中並需要一定的溫度，可以用雜交瓶或雜交袋並使液體不斷地在膜上流動。
雜交的顯影結果雜交液可以自制或從公司購買，不同的雜交液配方相差較大，雜交溫度也不同。下面給出的為一雜交液配方：
PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50%甲醯胺。該雜交液的雜交溫度為42℃。
1．預雜交
NC膜浸入2×SSC中5min，在雜交瓶中加入雜交液（8cm×8 cm的膜加5mL即可），將膜的背面貼緊雜交瓶壁，正面朝向雜交液。放入42℃雜交爐中，使雜交體系升溫到42℃。取經超聲粉碎的鮭魚精DNA 100℃加熱變性5min，迅速加到雜交瓶中，使其濃度達到100μg/mL。繼續雜交4h。鮭魚精DNA的作用是封閉NC膜上沒有DNA轉移的位點，降低雜交背景、提高雜交特異性。
2．雜交
倒出預雜交的雜交液，換入等量新的已升溫至42℃的雜交液，同樣加入變性的鮭魚精DNA。將探針100℃加熱5min，使其變性，迅速加到雜交瓶中。42℃雜交過夜。
洗膜與檢測
取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然後按照下列條件洗膜：
2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min；
0.1×SSC/0.1% SDS，56℃，10min。
在洗膜的過程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強度。經驗證明，當放射強度指示數值較環境背景高1-2倍時，是洗膜的終止點。上述洗膜過程無論在哪一步達到終點，都必須停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用濾紙吸乾膜表面的水分，並用保鮮膜包裹，注意保鮮膜與NC膜之間不能有氣泡。將膜正面向上，放入暗盒中（加雙側增感屏），在暗室的紅光下，貼覆兩張X射線底片，每一片都用透明膠帶固定，合上暗盒，置-70℃低溫冰櫃中曝光。根據信號強弱決定曝光時間，一般在1-3天時間。洗片時，先洗一張X光片，若感光偏弱，則再多加兩天曝光時間，再洗第二張片子。
Southern 雜交的成功取決於很多因素, 包括目的DNA 在總DNA 中所占的比例、探針的大小和比活性、轉移到濾膜上的DNA 量以及探針與目的DNA 間的同源性等。通常，如果將10μg 基因組DNA 轉移到膜上並與探針雜交， Southern 雜交可檢測出約1pg 的單拷貝目標DNA。
鑑定方法
發布日期：2008-07-17來源：生技網信息中心瀏覽次數：231
1）取10ul待測DNA，於一定濃度的瓊脂糖凝膠上進行電泳。(20mL,1.0%凝膠,)2)凝膠用溴化乙錠染色，切掉凝膠四周多餘部分，並在凝
1）取10ul待測DNA，於一定濃度的瓊脂糖凝膠上進行電泳。(20mL,1.0%凝膠,)
2)凝膠用溴化乙錠染色，切掉凝膠四周多餘部分，並在凝膠的一角作一記號,拍照
記錄電泳結果(拍照時,凝膠旁放一尺子)。
3)雜交用膠的製備(做以下步驟兩組合一)
A．將凝膠浸沒入30mL0.25mol/LHCl溶液中15min，使DNA脫嘌呤。
B．用蒸餾水短暫洗凝膠2次。
C．將凝膠浸沒入30mL變性液中30min,使凝膠變性。
D．將凝膠浸沒入30mL中和液中15min使它被中和。
重複D一次。在製備雜交用膠時準備轉移的平台、膜、濾紙等(4、5)。
4)準備DNA從凝膠向膜轉移的平台
5)將1張待用尼龍膜和3張厚濾紙切成與待轉移膠相同大小，並在尼龍膜一角做一標記。另1張厚濾紙切成與凝膠相同寬度，長度(約18cm)足以達到轉移液盒子的底部。準備10XSSC轉移液。
將待用尼龍膜用蒸餾水浸濕後，再浸入10XSSC轉移液中。
6）安裝毛細管轉移裝置
A．將長的濾紙放在轉移平台的頂部，濾紙兩端達到轉移盒的底部，做成虹吸橋。
B．將80mL轉移液倒入轉移盒內，並濕潤濾紙。
C．將凝膠背面朝上置於濾紙搭成的橋上，凝膠與濾紙間避免有氣泡。
D．用保鮮紙封住凝膠四邊。
E．將浸濕的轉移膜置於凝膠的上部，凝膠與膜間避免有氣泡。
F．將剩下的3張濾紙小心的放在轉移膜的上面，並放一疊吸水紙搭在濾紙上，再放一玻璃板，其上壓一重物。
G．轉移幾小時或過夜(至少4小時)
注意：勿使轉移液乾枯。
7)已轉移的DNA與膜交聯
A．將膜放在浸有10XSSC的厚濾紙上，有DNA的一面朝上。
B．將膜置於UVcrosslinker中，在紫外光下自動交聯。
C．用蒸餾水短暫的漂洗已交聯的膜，空氣中乾燥。
此膜可在4oC長期保存。
8)DNA探針的製備(略過)
參照生產商提供的實驗方法合成地高辛標記的探針。
9）印跡的預雜交
將適量的預雜交液DIGEasyHyb在42oC預熱。放入印跡膜,在42oC預雜交30min。
10)準備探針
水煮地高辛標記的探針5min使變性,並立即放在冰上2min.
11)加適量的探針到已預熱的雜交液中,混合均勻(避免形成泡沫,影響雜交效果)。42oC雜交至少4小時或過夜。
注意:不要將探針直接加在印跡膜上，而應加在容器一角的預雜交液中
12）印跡膜的沖洗：
A．將雜交液倒出，儲存起來可再次使用。
B．用25mL的2XSSC,0.1%SDS在室溫搖動洗膜2次,每次5min.
C．用已預熱的30mL0.5XSSC,0.1%SDS在65oC搖動洗膜2次,每次15min(用雜交爐).
13)免疫檢測:
A.用10mL沖洗液洗膜1-5min.
B.膜在15mL阻斷液中孵育30min
C.膜和8mL抗體孵育30min
D.在15mL沖洗液中洗膜2次,每次15min.
E.在15mL檢測液中平衡2-5min.
14)將膜的有DNA的面朝上,放在保鮮紙上,滴數滴CSPDready-to-use覆蓋膜;然後,立即用保鮮紙包裹,擠掉多餘的CSPDready-to-use,使其均勻平鋪在膜上,沒有氣泡,但避免使膜幹掉.室溫孵育5min.
15)在37oC孵育潮濕的膜10min,增強發光.
16)用X-光底片將雜交膜進行曝光10-25min.(發光性能至少可持續48小時)
17)X-光底片的沖洗
Agfa30顯影液顯影(1-5min)---沖水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水沖洗---晾乾底片。
結果及注意
在膜上陽性反應呈帶狀。實驗中應注意以下問題：轉膜必需充分，要保證DNA已轉到膜上。雜交條件及漂洗是保證陽性結果和背景反差對比好的關鍵。洗膜不充分會導致背景太深，洗膜過度又可能導致假陰性。若用到有毒物質，必需注意環保及安全。
主要套用
1.遺傳病診斷
2.DNA圖譜分析
3.PCR產物分析
影響
核酸分子雜交和印跡技術已成為分子生物學研究的一項基本技術，包括檢測DNA的Southern印跡、檢測RNA的Northern印跡和檢測蛋白質的western印跡，這些技術在遺傳病的基因診斷、基因組定量和定性分析、特異蛋白質檢測、性別分析和親子鑑定過程中發揮著極為重要的作用，這些技術的最初突破則是由埃德溫•邁勒•薩瑟恩爵士於1975年完成的Southern雜交。而且當今生物技術領域中占有舉足輕重地位的生物晶片技術（Microarray技術）其實也是一種基於核酸分子雜交和印跡技術的衍生技術。
基因晶片實驗結果 每一個點為一個基因
左側為人類基因組晶片 右側為鼠基因組晶片