缺口末端標記技術
末端標記1、前期處理
為確保離體組織的凋亡檢測效果，值得高度重視的是離體組織固定須在組織離體後15min內進行，否則組織發生自溶就會出現DNA的斷裂，影響檢測結果。我們在工作中套用10%中性甲醛作為固定劑，其在保持組織細胞結構的完整性、組織滲透性［1］上的效果優良。適宜的固定時間為常溫條件下4h～24h，根據組織大小做相應調整。切片要求平整，厚度以4μm～5μm［2］為宜。儘量避免因刀的缺口造成組織劃痕，以免影響組織細胞的形態完整，出現非特異性著色。56℃～60℃恆溫箱裡烤片4h，可保證不脫片，但需謹防高溫烤片對組織的破壞，因為在高溫乾燥條件下可以加速組織切片中的氧化。對於切片的保存，許多大的實驗室研究人員習慣將組織蠟塊連續切片後長期保存在室溫條件下，切片後的組織在室溫下長期保存也會加速組織切片的氧化，所以在實際工作中可以採用蠟封切片來避免氧化損失以便長期保存。脫蠟務必乾淨，當室溫低於25℃時，筆者把二甲苯置入37℃溫箱內，每缸10min，以保證脫蠟徹底，否則可能導致染色結果的異常。
末端標記TUNEL技術中常用的緩衝液是磷酸鹽緩衝液(PBS)。一般認為，緩衝液的離子濃度和pH值對最終結果均有影響，故PBS的濃度應以0.01mol/L,pH值7.2～7.4為宜。每次清洗均應注意時間，避免PBS沖洗不充分引起的背景著色。
3、非特異性染色
內源性過氧化物酶是引起非特異性染色的重要原因，如果不進行處理，組織中的紅細胞、粒細胞可以干擾染色結果的判斷。一般採用比較緩和的方法：3%過氧化氫封閉消除內源性過氧化物酶的活性，對染色結果沒有影響。筆者在預實驗過程中對3%過氧化氫作用時間分別設定0min、5min、10min三組進行比較，發現作用10min的組織切片背景非特異性著色明顯少於作用5min及0min的切片，檢測效果最佳。
4、蛋白酶K的消化時間組織
經甲醛固定後，可產生廣泛的蛋白質交聯，蛋白酶K的作用在於能夠暴露因組織固定而導致的抗原決定簇的封閉，以增強染色效果。有實驗表明：不同濃度蛋白酶K及其不同消化時間對於暴露DNA斷端有影響，並可產生不同的檢測結果［3］。筆者用蛋白酶K(20μg/ml，溶於pH7.4～8.0的0.01mol/LTrisHCl中)37℃，不同消化時間進行分組比較，結果發現消化30min的組織切片陽性細胞數多於消化20min及10min的切片，且陽性細胞與陰性細胞色彩對比分明、背景清晰。這可能是因為消化時間延長，導致細胞膜上更多通道形成，利於TdT酶的滲透所致，同時還要注意蛋白酶K應現用現配，以增強消化效果。
5、TUNEL反應液
TUNEL技術的關鍵是TUNEL反應液需要新鮮配製，在臨用前從低溫冰櫃取出混合均勻，放至冰浴中備用。筆者發現配製好的TUNEL反應液4℃放置2d，-20℃放置1周仍可以保證正常使用，但超過上述時間檢測效果就差了許多，甚至出現完全的假陰性結果，故新鮮配製非常重要。加入反應液後切片需放入37℃恆溫箱中1h並要保持切片濕潤，避免乾涸，以保證反應充分，否則實驗結果不佳，整個過程還應注意避光。
末端標記使用螢光素標記的辣根過氧化物酶檢測系統時，為了保證POD轉換液滲透均勻及其反應過程避免乾涸，需注意轉換液使用劑量和作用時間的控制，以免影響顯色效果，筆者使用50μl作用30min，效果良好。
7、顯色筆者
採用AEC或者DAB顯色。顯色液一定要注意現用現配，配製好的溶液避光存放，30min內有效，AEC染色結果為紅色，DAB為棕黃色。相比之下，AEC因為色彩絢麗，對比清晰而更利於顯微照相。顯色一定要在顯微鏡下控制深淺，以陽性對照片內的顯色情況為參考，其出現稍濃於目的色的時間就是該片的顯色時間。由於不同組織、室溫、水質等條件都對顯色有較大影響，所以不能絕對固定時間，8min～20min比較合適。如室溫較高，時間應縮短；室溫較低，應適當延長，但也不可超過20min，否則背景易著色。
8、復染
對於細胞凋亡的程度常用細胞凋亡指數這一指標來評估［4］，為此蘇木素復染是十分必要的，否則陰性細胞核不易被觀察到。蘇木素染色時間30s～20min，要根據實際情況和需要嚴格鏡下掌握。
9、封片
使用AEC水溶性封片劑進行封片，需防止封片後組織切片內小水泡出現影響到製片質量、組織細胞的觀察和顯微拍照效果。解決這一問題的辦法主要是在封片前將從低溫冰櫃取出的封片劑置入37℃恆溫箱中30min，待之完全融化後再加以使用。切片若要長期保存，可待AEC封片劑完全乾燥後，再用中性樹膠加蓋蓋玻片封片，同時也更有利於顯微照相。DAB顯色後則直接用中性樹膠封片。TUNEL技術中嚴格進行每一步驟的操作非常重要，每一個細節都有可能對最後的結果造成很大的影響，只有仔細認真操作才得到客觀滿意的結果。
