定義
是識別DNA的特異序列，並在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。
由來
限制性核酸內切酶 限制性內切酶（restriction endonuclease）：一種在特殊核苷酸序列處水解雙鏈DNA的內切酶。Ⅰ型限制性內切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內切酶只催化非甲基化的DNA的水解。
別名 Endodeoxyribonuclease簡稱限制酶
酶反應 限制性內切酶能分裂DNA分子在一限定數目的專一部位上。它能識別外源DNA並將其降解。
單位定義 在指明pH與37℃，在0.05mL反應混合物中，1小時消化1μg的λDNA的酶量為1單位。
性狀製品不含非專一的核酸水解酶（由10單位內切酶與1μg λDNA，保溫16小時所得的凝膠電泳圖譜的穩定性表示），這類酶主要是從原核生物中分離出來的，迄今已經從近300多種不同的微生物中分離出約4000種限制酶。
分布
區域
限制性核酸內切酶分布極廣，幾乎在所有細菌的屬、種中都發現至少一種限制性內切酶，多者在一屬中就有幾十種，例如在嗜血桿菌屬中（Haemophilus）現已發現的就有22種。有的菌株含酶量極低，很難分離定性；然而在有的菌株中，酶含量極高．如E. coli的pMB4(EcoRI酶）和H. aegyptius(Hal Ⅲ酶）就是高產酶菌株。據報導從10g的H. aegyptius的細胞中，能分離提純出可消化l0gλ噬茵體DNA的酶量。到目前為止，細菌是限制性內切酶，尤其是特異性非常強的I類限制性內切酶的主要來源。
分類性質
根據酶的功能特性、大小及反應時所需的輔助因子，限制性內切酶可分為兩大類，即I類酶和Ⅱ酶。最早從大腸桿菌中發現的EcoK、EcoB就屬於I類酶。其分子量較大；反應過程中除需Mg2+外，還需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP；在DNA分子上沒有特異性的酶解片斷，這是I、Ⅱ類酶之間最明顯的差異。因此，I類酶作為DNA的分析工具價值不大。Ⅱ類酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。其分子量小於105道爾頓；反應只需Mg2+；最重要的是在所識別的特定鹼基順序上有特異性的切點，因而DNA分子經過Ⅱ類酶作用後，可產生特異性的酶解片斷，這些片斷可用凝膠電泳法進行分離、鑑別。
限制性內切酶識別DNA序列中的迴文序列。有些酶的切割位點在回文的一側（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ類酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位點在迴文序列中間，形成平整末端。Alu I的切割位點如下：
5'-A G^C T-3'
3'-T C^G A-5'
在已發現的限制性內切酶中，近百種酶的識別順序已被測定。有很多來源不同的酶有相同的鹼基識別順序，這種酶稱為“異源同功酶”（isochizomer，同切限制內切酶；同裂酶）。應該注意的是，這些酶雖然有相同的識別順序，但它們的切點並不完全一樣。例如Xma I和Sma I都識別六核苷酸CCCGGG，但Xma I的切點在cCCGGG，而Ema I的切點則在CCCGgGG，前者切割DNA分子，形成帶有CCGG粘性末端的DNA片段，而後者並不形成粘性末端。當然，也有識別順序和切點都相同的酶，如Hap Ⅱ、Hpa Ⅱ、Mno I，都在識別順序CCGG內有一相同的切點，Hal Ⅲ和BsuR I同樣在識別順序GGCC內有一相同的切點。
用途
用於DNA基因組物理圖譜的組建；基因的定位和基因分離；DNA分子鹼基序列分析；比較相關的DNA分子和遺傳工程。
限制性核酸內切酶是由細菌產生的，其生理意義是提高自身的防禦能力.
限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。
命名
限制酶的命名是根據細菌種類而定，以EcoRI為例：
| E | Escherichia | （屬） |
| co | coli | （種） |
| R | RY13 | （品系） |
| I | 首先發現 | 在此類細菌中發現的順序 |
類型
根據限制酶的結構，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（Type I）、第二型（Type Ⅱ）及第三型（Type Ⅲ）。
第一型限制酶
同時具有修飾（modification）及認知切割（restriction）的作用；另有認知（recognize)DNA上特定鹼基序列的能力，通常其切割位（cleavage site）距離認知位（recognition site）可達數千個鹼基之遠。例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶
只具有認知切割的作用，修飾作用由其他酶進行。所認知的位置多為短的迴文序列（palindrome sequence）；所剪下的鹼基序列通常即為所認知的序列。是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類。例如：EcoRI、HindⅢ。
第三型限制酶
與第一型限制酶類似，同時具有修飾及認知切割的作用。可認知短的不對稱序列，切割位與認知序列約距24-26個鹼基對。例如：HinfⅢ。
生理意義
限制作用實際就是限制酶降解外源DNA ，維護宿主遺傳穩定的保護機制。甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保護。通過甲基化作用達到識別自身遺傳物質和外來遺傳物質的目的。所以，能產生防禦病毒侵染的限制酶的細菌，其自身的基因組中可能有該酶識別的序列，只是該識別序列或酶切位點被甲基化了。但並不是說一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多數限制酶對DNA甲基化敏感，因此當限制酶目標序列與甲基化位點重疊時，對酶切的影響有3種可能，即不影響、部分影響、完全阻止。對甲基化DNA的切割能力是限制酶內在和不可預測的特性，因此，為有效的切割DNA，必須同時考慮DNA甲基化和限制酶對該類型甲基化的敏感性。另外，現在很多商業限制酶專門用於切割甲基化DNA。
