簡介
粘性放線菌19246胞壁表面有大量的傘狀物存在,其胞壁厚度約為26～29nm,和T14-V的電鏡研究結果一致,形態學研究表明粘性放線茵19246是有毒菌株。胞壁化學成分分析表明聚肽糖占主要成分,約為41%,其他為糖(24%)和蛋白質(13.6%)。目前不少人認為聚肽糖和傘狀物是粘性放線菌的毒力所在。
相關資料
粘性放線菌(以下簡稱粘放菌)與齲病(尤其是根面齲)以及牙周病的發生均有關［1,2］。其致病作用的首要條件是它對宿主的粘附和定居。眾多研究結果表明［3,4］,粘放菌表面的菌毛與粘放菌的粘附有關。粘放菌有兩種功能及抗原性不同的菌毛:Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛。隨著對粘放菌粘附機理的深入研究［5,6］,認為菌毛上存在與粘附有關的蛋白質,即粘結素。目前,對粘放菌菌毛上粘結素的結構與成分尚不清楚。為了深入研究兩種菌毛的生物性能,以及菌毛上的粘結素,提取粘放菌菌毛成為研究的起點。目前,國內尚未見這方面的報導。本實驗旨在建立一套提取和鑑定粘放菌菌毛的法。
1材料和方法
1.1實驗材料
粘放菌5519(1+2-)和5951(1-2+)由上海第二醫科大學口腔醫學研究所劉正教授惠贈。抗Ⅰ型菌毛和抗Ⅱ型菌毛的多克隆抗體由美國Florida大學Nesbitt教授惠贈。凝膠過濾柱Sepharose6B由美國Sigma公司提供。
1.2細菌的培養和收集
選用胰蛋白腖大豆瓊脂(TSB)非選擇性厭氧菌培養基。37℃厭氧培養(80%N2,20%CO2),經形態染色、生化鑑定及血清學鑑定符合標準後,納入實驗菌株。根據兩種菌毛的生物學性能的差異,確定5519隻有Ⅰ型菌毛,5951隻有Ⅱ型菌毛。
將粘放菌5519、5951分別接種於TSB固體培養基上,37℃厭氧培養48小時,用0.01mol/LPBS緩衝液(pH7.0)洗下平板上的細菌,分別離心收集兩種細菌(3000r/min,10分鐘),再加入0.01mol/LPBS緩衝液。
1.3菌毛的分離
參照機械攪動法［7,8］分離菌毛與胞壁。在4℃冰櫃內,磁力攪拌器攪拌菌懸液5分鐘,4℃高速離心(12000×g,20分鐘),收集上清液。將細菌沉澱按上述過程再處理1次。合併2次離心的上清液,為菌毛粗提物。
1.4菌毛的提純
用20%飽和硫酸銨沉澱上清液［4,9］,4℃高速離心(16000×g,30分鐘),沉澱用少量0.01mol/LPBS緩衝液溶解,並用相同的緩衝液反覆透析2天,收集蛋白溶液,即為初步純化菌毛。貯存於-20℃冰櫃內備用。
預先用0.01mol/LPBS緩衝液(pH7.0)平衡Sepharose6B柱。將1.5ml初步純化菌毛蛋白上樣,用同樣緩衝液洗脫(5ml/h),收集樣品(2ml/管)。紫外線分光光度計測定每管OD280nm值,計算機繪製洗脫圖譜。合併電鏡觀察到含有菌毛的組分,即為部份純化菌毛。冷凍乾燥。
將部份純化菌毛溶於1.0ml緩衝液中,再次上樣,按上述方法經Sepharose6B柱層析進一步分離純化。
1.5菌毛的鑑定
1.5.1電鏡觀察參照Clark等、劉正等［10,11］介紹的方法觀察菌毛在處理前後的細菌表面及不同階段提取物中存在與否。
1.5.2免疫學鑑定採用對流免疫電泳法鑑定。抗原為Ⅰ型或Ⅱ型菌毛的粗提物、部份純化菌毛和純化菌毛。抗體為抗Ⅰ型菌毛或抗Ⅱ型菌毛的多克隆抗體。
2結果
2.1菌毛的提取結果
粘放菌5519、5951培養48小時後,電鏡觀察可見菌體表面有長短不一的菌毛(圖1)。機械攪動2次後,菌體表面菌毛基本消失,菌體完整(圖2)。說明本實驗採用的方法使菌毛與菌體間有最大程度的分離。
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