抑制差減雜交

抑制差減雜交方法是一種新的鑑別差異表達基因的方法。

抑制差減雜交（SSH）SSH是一種基於抑制PCR和差減雜交技術建立的,在轉錄水平上研究基因表達的技術,具有穩定、高效、可靠的特點,可對生物的生長、發育、衰老、死亡等生命過程及生物或非生物逆境脅迫對生物所造成的影響等進行全面、系統的分析。
抑制差減雜交( suppression subtractive hybridization, SSH)是基於抑制PCR和差減雜交技術建立的簡單有效的方法[1],通過一次差減雜交可使低豐度的序列(mRNA)得以高於1000倍的富集,有效的選擇性擴增目標序列,同時抑制非目標序列的擴增,因此在分離基因特別是分離低豐度差異表達基因方面具有更廣闊的套用前景。
抑制差減雜交技術運用了雜交二級動力學原理,即高豐度的單鏈cDNA在退火時產生同源雜交的速度快於低豐度的單鏈cDNA,在試驗組(tester)和驅動組(driver)的cDNA變性後再復性的過程中,原來在豐度上有差別的單鏈cDNA達到均一化。同時,由於試驗組的cDNA在進行雜交之前等分的兩份加有不同的接頭,因此雜交時將產生5種不同類型的分子a、b、c、d和e(圖1),當採用與兩個不同接頭序列互補的引物進行PCR擴增時,只有目標序列得到有效擴增,非目標序列因兩端存在反向重複序列,退火時易產生類似”鍋柄”的結構,無法與引物配對,擴增受到抑制。
抑制差減雜交(SSH)技術的主要步驟有:(1)cDNA的合成與酶切;(2)試驗組cDNA分成兩份,並與兩個不同的接頭連線;(3)試驗組的cDNA與過量的驅動組cDNA雜交;(4)選擇性PCR擴增與接頭相連的試驗組cDNA分子;(5)克隆PCR產物,構建差減文庫;(6)篩選文庫。
SSH方法一般只用於兩個樣品的差異比較分析,樣品間的差異不宜太大或太小,而對於多個樣品則無能為力,這在很大程度上限制了它的套用。提取tester RNA的時期非常關鍵,選擇使用該方法時,首先要根據不同的研究目的確定取材的最佳時期,取材時期不當將會給試驗帶來意想不到的困難,或許只得到很少幾個差減克隆或根本得不到克隆,或得到一些非目的克隆。從技術本身講,提取的tester RNA和driver RNA及從中分離的mRNA的質量、限制酶的酶切效率、接頭的連線效率、第二次PCR產物的轉化效率及差減克隆的篩選方法等關係著驗的成敗。另外SSH所需的起始RNA量較大,一般為幾微克,對於一些珍貴稀有的不易獲得足夠RNA的材料要慎重使
用。
SSH方法在研究植物基因的差異表達方面已得到有效套用,該方法在套用範圍和深度上可進一步拓寬和加深:(1)利用SSH方法研究生物(如細菌和真菌等)和非生物逆境(如乾旱和寒冷等)對植物的影響及生物與寄主植物的互作時,可進一步提早取材時期(如逆境誘導後的6小時或更早)和縮短取材間隔,以獲得植物差異表達基因的表達動態和進行有關轉錄因子等方面的研究,進而獲得植物與逆境互作的關鍵點,更好地理解其互作機制,為從分子水平上定向培育抗旱、抗寒、抗病等作物提供更可靠的理論依據。(2)將獲得的一些差異表達基因片段轉化為分子標記,進行標記輔助選擇,進一步為育種服務。(3)衰老、凋亡同生長、發育一樣也是植物的重要生命活動過程,利用SSH研究了解作物的衰老、凋亡機制,適當有效地延長或縮短作物的生命周期,對於提高作物的生物產量和經濟產量均具有重要意義。就馬鈴薯育種研究工作而言,工作重點主要集中在抗逆(如抗病、抗旱等)、品質及產量等方面,利用該方法可進一步了解其機制,將所獲得的相關基因轉化為分子標記等,可加速馬鈴薯抗逆、品質改良和產量等方面的育種研究進程。目前我們實驗正在套用該項技術進行馬鈴薯青枯病抗性相關基因的分離工作,並擬建立病菌誘導後特定時期的基因表達譜,以初步揭示其抗性機制,為今後順利開展馬鈴薯抗青枯病育種奠定基礎。(4)基因的協同表達是植物分子生物學研究的一個重要領域,SSH方法在轉錄水平上作為研究生物基因表達的重要方法,可為研究者展示所研究生物某一特定時期的基因表達輪廓,此領域的研究將成為今後植物分子生物學研究的一個熱點。