差異展示
RNA差異展示（mRNA differential display,DDRT-PCR）是目前篩選差異表達基因最有效的方法之一，其基本原理是：3%26acute;端採用錨定引物，與mRNA3%26acute;poly a結合，進行反轉錄，形成mRNA：cDNA雜交分子，5%26acute;端採用20條隨機引物，與錨定引物一起進行PCR擴增，其產物經測序膠顯示出來，再回收鑑定克隆差異條帶。1992年Liang和Pardee[1]建立此技術時，5%26acute;端採用20條隨機引物，每條由10個鹼基組成，3%26acute;端採用12條引物即T12MN(M=A、C或G，N=A、G、C、T)。這種組合從統計學上幾乎能完全覆蓋所有的mRNA序列，差異表達的基因會全部呈現出來。實踐證明，這種方法有效，但假陽性率在50%～70%左右，差異條帶在Northern印跡上重現性差，後續處理也比較複雜。1994年Ito[2]等對3%26acute;端引物進行了改進，把12條引物改為3條，即T12A、T12C、T12G，使得實驗操作簡化。1995年Ayala[3]等提出了在3%26acute;端錨定引物與5%26acute;端隨機引物上皆增加10個鹼基，使得上下游引物Tm值在60℃左右，PCR循環參數也改為前5個循環採用Liang和Pardee推薦的參數，即94℃30s，40℃2min,72℃30s。經這樣改進，顯著地增強了差異條帶的重複性和敏感性，同時使得差異條逼帶的克隆十分方便。1996年4月，Liang和Pardee[4]對5%26acute;端此物進行了改進，引物條數改為8條，皆帶上HindⅢ酶切位點，每條由13個鹼基組成，3%26acute;端錨定引物採用3條，也帶上HindⅢ酶切位點，每條由18個鹼基組成，PCR循環條件仍採用94℃30s,40℃2min,72℃30s,40個循環，最後在72℃延伸7min。1998年[5]我們在Liang和Pardee改進的基礎上，對PCR循環參數進行了改進，即前5個循環採用94℃30s,40℃2min,72℃30s,後35個循環採用94℃30s,55℃2min,72℃30s，最後在72℃延伸7min。經這樣改進，既保持了擴增效率，又增強了差異條帶的特異性及重複性，降低了假陽性率。
總之，mRNA差異展示具有簡便、快速、所需起始材料少、同時可在多個材料之間或不同處理材料之間進行比較等優點，但具有較高頻率的假陽性和短小的差異片段的缺點，給後續處理帶來一系列問題，雖然此技術經過了一些起改進，但這兩個缺點仍限制著此方法的充分套用。
代表性差示分析
代表性差示分析（representational difference analysis,RDA）最早由Lisitsyn等提出的。1994年，Hubank和Schatz[6]將其套用於克隆差異表達基因，其基本原理是：靶方（Tester,T）和驅動方（Driver,D）的cDNA在進行差方式分析前均用一種識別4鹼基序列的限制酶作切割處理，形成平均長度為256bp的cDNA片段代表群，第一次T與D雜交反應時，兩者總量比為1：100，第二次增加到1：400，第三次增加到1：8000，再利用PCR以指數形式擴增雙鏈模板，而僅以線性形式擴增單鏈模板這一特性，通過降低cDNA群體複雜度和多次更換cDNA兩端接頭，來特異擴增目的基因片段。特別是T減D雜交反應後僅設定了72℃復性與延伸及95℃變性這兩個循環參數，共20個循環，從而使PCR產物特異性大大提高。此技術最大的優勢是差異條帶在Northern印跡上重現性好，假陽性少。缺點是所需起始材料較多，更多信賴於PCR技術，T與D之間若存在較多差異，或T中存在某些基因上調錶達，則難達到預期目的，而且工作量比DDRT-PCR大，周期長。
抑制性扣除雜交
抑制性扣除雜交（suppression subtractive hybridization,SSH），是1996年Diatchenk[7]等提出的一種新的克隆基因技術，其基本原理是：先將T與D方cDNA用限制酶切割為小片段，將T方平均分為兩份，分別連線不同的接頭，然後與過量的D方cDNA進行不充分雜交。根據復性動力學原理，濃度高的單鏈分子迅速復發，而濃度低的單鏈分子仍以單鏈形式存在。然後混合兩份雜交樣品，同時加入新的變性D方cDNA進行第二次扣除雜交，雜交完全後補平末端，加入合適引物接頭（接頭1與接頭2引物）進行PCR擴增。當DNA兩條鏈含相同接頭時，其PCR擴增受到抑制，而含不同接頭的雙鏈DNA分子才可進行指數擴增，其產物即為目的片段。
此技術避免了消減雜交過程中分離單雙鏈DNA的步驟，可成千倍地擴增目的片段，能分離出T方上調錶達的基因，與DDRT-PCR相比，具有假陽性少重複性強的優點，它的最大不足就是需要較多的起始材料，更多依賴於PCR技術，不能同時進行數個材料之間或不同處理材料之間的比較。
差異消減展示
差異消減展示（differential subtraction display,DSD）是1998年Jose等[8]提出的，它是在DDTR-PCR呈現出差異條帶之後，同時回收差異條帶與對照方的相應範圍的條帶，靶方回收的差異條帶用非生物素標記的引物與dNTPs進行PCR擴增，而對照方回收的差異條帶用含生物素標記的dATP的dNTPs進行PCR擴增，其產物進行消減雜交，用鏈親和素去除共有的產物，剩下的產物由帶有α-32P dATP的dNTPs進行擴增，再重複差異展示，回收差異條帶並克隆。此技術最大的優勢是獲得差異條帶在Northern印跡上重現性好，假陽性少，敏感性強，可獲得長片段，起始材料要求少，可獲取低豐度差異表達基因，缺點是步驟繁瑣，工作量大，周期性長，更多依賴於PCR技術。
另外，趙忠良博士把長片段PCR擴增（LPCR）與消並減雜交技術結合起來，建立了LPS技術，並運用此技術從抗原呈細胞中獲取了170多個差異表達基因。此技術的基因原理是：T與D方分離出cDNA後，運用5%26acute;端帽子引物與3%26acute;端錨定引物，對cDNA進行大量擴增，其產物直接進行消減雜交，然後過柱子，去除相同的基因，剩餘的部分再與D方cDNA進行二輪消減雜交，再過柱子，去除非差異部分，剩下的差異部分進行第三輪消減雜交，其產物進行分級分段克隆。這種方法最大的好處是：起始材料需要少，可獲得差異基因，假陽性少，有可能獲得全長差異表達基因。
總之，隨著高效擴增的Taq酶與具有自動校正功能的Taq酶的出現，長片段PCR擴增技術的最佳化，差異表達基因克隆技術將會不斷發展，但目前主要有以上幾種方法，各有其優缺點，研究者應根據自己的實際情況，選擇合適的技術方法，以其達到自己預期的目的。
