抑制消減雜交技術

"存在於tester 中而不存在於driver 第一輪PCR

SSH 即抑制消減雜交技術是由Diatchenko 等於1996 年以m RNA 差別顯示技術為基礎建立起來的篩選未知差異表達基因的新技術。它主要基於最近出現的抑制PCR , 並結合標準化(normalization 或equalization ) 和消減雜交( substractive hybridization)。抑制PCR 通過利用含引物序列的雙連結頭(adaptor) 充當引物模板, 使兩端接上同一接頭的非目的雙鏈片段具有反向末端重複序列, PCR 中不能擴增, 從而達到抑制非目的片段而選擇性擴增目的片段的目的。標準化步驟平衡了目的基因群中cDNA 的豐度, 即低豐度差異表達的基因不會丟失, 而高豐度差異表達的基因又不會被過量分離。消減雜交則扣除了目的基因群( tester) 與驅趕基因群(driver) 間的同源序列。
存在於tester 中而不存在於driver 中, 或在tester 中較在driver 中有高水平表達。
①第一次差減雜交,用過量的drivercDNA分別與tester2adaptor1cDNA和tester2adaptor2cD2NA雜交。分別形成SSH技術原理圖所示的tester單鏈片段a、tester雙鏈片段b、tester2driver同源雙鏈片段c和driver單、雙鏈片段d。根據雜交二級動力學,豐度較高的分子產生同源雜交體(homo2hy2brid)的速度較快,使高豐度與低豐度單鏈片段a濃度大致相等,從而實現tester單鏈片段a的標準化[6],並使連線一種接頭的差異表達基因a初步富集。②第二次差減雜交,將上述分別與drivercDNA雜交後的tester2adaptor1和tester2adaptor2cDNA混合,再加入新製備的變性drivercDNA,因tester2adaptor1和tester2adaptor2cDNA同源,除形成a、b、c、d片段外,又形成了新的連線有兩種接頭的雙鏈雜交片段e,即連線兩種接頭的差異表達序列e,是進行PCR指數擴增的模板。
PCR之前填補分子粘性末端以利於退火。第一輪PCR,加入針對adaptor1和adaptor2外側序列的特異引物進行擴增。結果:a、d片段因沒有引物結合位點,不能進行PCR擴增;b片段由於兩端均為同一接頭,具有反向末端重複序列(invertedre2peats),在單鏈內部形成互補發卡結構的可能性及穩定性均大於引物與其配對結合的可能性及穩定性,故在PCR反應中不能擴增;c片段的一端為一種接頭而另一端無接頭,只能線形擴增;只有e片段末端有兩種不同接頭,可通過PCR作指數擴增。第二次PCR,加入一對與接頭內側序列相同的巢式PCR特異引物,進一步富集差異表達序列並降低背景。經過兩輪PCR,基於PCR抑制效應的存在,以及選用了兩對引物,可以特異擴增代表了差異表達的cDNA片段。
經上述PCR所得的差別表達基因片段可以利用接頭上存在的酶切位點,插入適當載體,轉化細菌。經X2Gal藍白菌落初步篩選,獲得具有差異表達cDNA片段的陽性克隆。然後通過Northern雜交鑑定,cDNA序列分析,可獲得一些新的ESTs序列,如進一步對該ESTs進行深入的結構和功能研究,可望獲得新的具有重要生物學作用的全長功能基因。