結構特點
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mRNA的含量最少,約占RNA總量的2%。mRNA一般都不穩定,代謝活躍,更新迅速,半衰期短。mRNA分子中從5′-未端到3′-未端每三個相鄰的核苷酸組成的三聯體代表胺基酸信息,稱為密碼子。mRNA的生物學功能是傳遞DNA的遺傳信息,指導蛋白質的生物合成。細胞內mRNA的種類很多,分子大小不一,由幾百至幾千個核苷酸組成。真核生物mRNA的一級結構有如下特點:
1.mRNA的3′-未端有一段含30~200個核苷酸殘基組成的多聚腺苷酸(polyA)。此段polyA不是直接從DNA轉錄而來,而是轉錄後逐個添加上去的。有人把polyA稱為mRNA的“靴”。原核生物一般無polyA的結構。此結構與mRNA由胞核轉位胞質及維持mRNA的結構穩定有關,它的長度決定mRNA的半衰期。
2.mRNA的5′-未端有一個7-甲基鳥嘌呤核苷三磷酸(m7Gppp)的“帽”式結構。此結構在蛋白質的生物合成過程中可促進核蛋白體與mRNA的結合,加速翻譯起始速度,並增強mRNA的穩定性,防止mRNA從頭水解。
在細胞核內合成的mRNA初級產物被稱為不均一核RNA(hnRNA),它們在核內迅速被加工、剪接成為成熟的mRNA並透出核膜到細胞質。
存在範圍和性質
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原核和真核生物mRNA有不同的特點:①原核生物mRNA常以多順反子(見)的形式存在,即一條mRNA鏈編碼幾種功能相關聯的蛋白質。真核生物mRNA一般以單順反子的形式存在,即一種mRNA只編碼一種蛋白質。②原核生物mRNA的轉錄與翻譯一般是偶聯的,即轉錄尚未完畢,蛋白質的轉譯合成就已開始。真核生物轉錄的mRNA前體則需經後加工,加工為成熟的mRNA與蛋白質結合生成信息體後才開始,工作信息體中蛋白質與RNA之比約為3。③原核生物mRNA半壽期很短,一般為幾分鐘,最長只有數小時(RNA噬菌體中的RNA除外)。真核生物mRNA的半壽期較長,如胚胎中的mRNA可達數日。④原核與真核生物mRNA的結構特點也不同。
一級結構與功能的關係:原核生物mRNA一般5'端有一段不翻譯區,稱前導順序,3'端有一段不翻譯區,中間是蛋白質的編碼區,一般編碼幾種蛋白質。如大腸桿菌乳糖操縱子mRNA編碼3條多肽鏈;色氨酸操縱子mRNA編碼5條多肽鏈。也有單順反子形式的細菌mRNA,如大腸桿菌脂蛋白mRNA。原核生物mRNA分子中一般沒有修飾核苷酸,也沒有5'端帽子結構和3'端聚腺苷酸尾巴。在原核生物mRNA的起始密碼子(AUG)附近(5'方向上游)的一小段長短不等的順序,含有較多的嘌呤核苷酸,被稱為SD順序。它能和核糖體小亞基上的16SrRNA的3'端富含嘧啶核苷酸的區域配對結合,有助於帶有甲醯甲硫氨酸的起始tRNA識別mRNA上的起始密碼(AUG),使肽鏈合成從此開始。這段順序是1974年由J.夏因和L.達爾加諾發現的,所以稱為SD順序,也稱核糖體結合部位。原核生物mRNA的編碼區一般編碼幾種功能上相關聯的蛋白質,兩種蛋白質的編碼區之間常有一小段不翻譯的順序,叫做間隔區。有的噬菌體RNA中2個相鄰的順反子共用一段相同的編碼順序,例如,M噬菌體RNA中的溶菌蛋白編碼區共225個核苷酸中有189個核苷酸是由相鄰兩個蛋白質共用的。原核mRNA與真核mRNA一樣使用同一套三聯體密碼子(真核生物線粒體mRNA有例外)。原核生物合成胺基酸的操縱子mRNA的5'端前導順序上有一段順序稱作弱化子。弱化子具有兩種可以互變的構象,其中一種構象是轉錄終止的信號,能使轉錄中止(或衰減)。衰減調節是原核生物合成胺基酸的調控方式之一。
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翻譯區(編碼區)使用的密碼子除線粒體(如人、牛和酵母線粒體)外與原核生物mRNA是一樣的。真核生物mRNA的起始密碼子都是AUG。真核和原核生物mRNA使用的密碼子也都有“簡併現象”,即幾種不同的密碼子翻譯出同一種胺基酸,但不同的mRNA中簡併密碼子的利用率是不同的,真核與原核生物之間的差別就更大。mRNA的終止密碼子有3個(UAG、UGA和UAA),其功能是停止翻譯,一般只用一個終止密碼子就能使翻譯停止。有的mRNA有2個連續的終止密碼子(見)。3'端不翻譯區的長短在不同的mRNA上有所不同,β珠蛋白mRNA只有39個核苷酸,而卵白蛋白mRNA則有637個核苷酸。真核生物mRNA3'端不翻譯區常有AAUAA(A)或AUUUA(A)等順序,它們和識別多聚A聚合酶及裝配多聚A尾巴有關。除個別組蛋白mRNA外,真核生物mRNA3'端均有多聚A尾巴3'端多聚A尾巴的長度隨來源不同而不同,且隨mRNA的老化而變短,通常有20~200個A多聚A與mRNA穩定性及mRNA從細胞核轉到細胞漿中有關。
新型的表達系統
此處描述的是一個新型的表達系統,用以從一個單一多順反子構建體中產生目的多基因產物。尤其是,該表達系統包含一個多順反子載體,能夠在真核宿主細胞中表達功能抗體,其中載體在5′-3′方向上至少包含下面的可操作連線的元件:在真核細胞可操作的啟動子;編碼至少抗體輕鏈可變區的DNA序列;內部核糖體進入位點(IRES);以及至少一個編碼抗體重鏈的DNA序列。也公開了包含多順反子表達載體的哺乳動物細胞,和一種在用多順反子表達載體轉染的哺乳動物細胞中產生功能抗體的方法。
新分節基因
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昆蟲的分節基因是早期胚胎產生體節必須的。在這篇論文中,德國的研究人員描述了擬谷盜的分節基因的gap家族的一個新成員mlpt。Mlpt基因的敲除會導致昆蟲腹節變成胸節,從而使胚胎產生多達10對足。
研究人員證實在mlpt和已知的擬谷盜Gap基因之間發生著互動調節反應,在表明mlpt本身就是一個gap基因(裂缺基因)。Mlpt基因能反映出一種不同尋常的結構,因為它編碼一種多順反子mRNA,而這種mRNA又編碼四種肽。
由於在其他昆蟲基因組中也發現了具有多順反子排列的同源基因,因此研究人員推測Mlpt似乎是真核細胞中這種先前未知的基因結構的原型。
新基因簇轉錄
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套用前景
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2、利用腦心肌炎病毒(EMCV)及脊髓灰質炎(polio)病毒核心糖體進入位點(IRES),連線mIL-12p40及p35cDNAs和篩選基因新黴素磷酸轉移酶(NeoR),克隆至逆轉錄病毒載體pGCEN中,使三個基因同時受逆轉錄病毒載體5′端LTR啟動子控制,轉錄至同一mRNA轉錄本上,通過不同機制翻譯成蛋白質,從而構建成多順反子逆轉錄病毒載體,即pGCEN/mIL-12。在LipofectAMINE介導下將pGCEN/mIL-12轉染包裝細胞PA317,G418篩選,直至出現陽性克隆,挑取抗性克隆,擴大培養,收集上清,用小鼠成纖維細胞NIH3T3測定病毒滴度。然後用重組轉錄病毒感染小鼠肝癌細胞MM45T.Li.G418篩選,直至出現抗性克隆,擴大培養,對陽性克隆進行鑑定。結果是由PA317包裝細胞產生的重組逆轉錄病毒的滴度為5×105CFU/ml,將其感染小鼠肝癌細胞MM45T.Li,後經PCR及Southernblot證明,外源基因已整合至小鼠肝癌細胞基因組中,RT-PCR及Northernblot分析外源基因在mRNA水平上的表達,並證實mIL-12p40及p35cDNA和NeoR基因轉錄在同一mRNA上。ELISA顯示mIL-12的表達量48h為10ng/106細胞。並且M45/mIL-12培養上清能刺激人外周血單個核細胞增殖及誘導小鼠脾細胞IFN-γ的產生(160U/ml)。
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本研究項目中造血幹細胞採用的是臍血幹細胞[wangjishi,etal.LeukemiaReaearch.2002,26(3)281-288;實驗生物學報2001,34(3)227-233]\外周血CD34+細胞[wangjishi,FangQinetaL.AxtaPharmacologicaSinica.2001,22(10):949-955]和小鼠骨髓細胞,轉染靶細胞顯示對化療藥物的抗性增加。有效表達,增加了細胞對亞硝基類藥物(如BCNU)的耐愛性,證實該基因具有明顯的細胞生物學效應。同進通過體外誘導突變技術獲得了突變型MGMT,並成功構建到逆轉錄病毒載體上。本研究為同內首次以RT-PCR方法從人肝組織克隆了06-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶(MGMT)基因,與人類基因文庫MGMT基因同源性比為100%,將該基因導入靶細胞後顯示有效表達,增加了細胞對亞硝基類藥物(如BCNU)的耐受性,證實該基因具有明顯的細胞生物學效應。同進通過體外誘導突變技術獲得了突變型MGMT,並成功構建到逆轉錄病毒載體上。
本研究課題構建了國內外尚未報導的含ALDH1、ALDH3基因與IRES-MDRI基因的雙順反子逆病毒表達載體。同時證實了ALDH1、ALDH3均有抗活性環磷醯胺作用。在多順反子逆病毒表達載體GLNA-MGMT-NEOR-IRES-MDRI中,利用NEOR基因和MDRI的雙重作用建立了雙標記系統。研究中涉及到了DNA序列分析,桌球效應,RT-PCR,PCR,NORTHERNBLOT,WESTERNBLOT,FACS,MTT、建立高滴度產病毒細胞體系和安全高效的基因轉移系統。