簡介
G418通過干擾 核糖體的功能而阻斷細胞的蛋白合成
使用方法
室溫下運輸, 乾粉在室溫下儲存，溶於水、甲醇，溶液於-20℃儲存 由於各真核細胞系對G418敏感度不同,各新細胞系或株 穩定轉染時殺死非穩定轉染細胞所需用量需要通過實驗最佳化。最適用量通過建立細胞死亡曲線獲得。將細胞稀釋至1000cell/ml，每孔100ul加入有培養基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml等12個級別, 培養10-14天，以細胞全部死亡最低濃度為基準，一般400-800左右，篩選時比該濃度再高一個級別，維持時使用篩選濃度的一半即可。
濃度範圍
細胞系或機體 G418濃度（ug/ml）
中國倉鼠卵巢細胞700～800
Madin－Darby犬腎細胞 500
人上皮A431細胞 400
猿CV-1細胞 500
盤基網柄菌屬 10～35
植物 10
酵母125～500
質量指標
G418 ：白色粉末，融點138～144℃，溶於水、甲醇。 CAS No.：108321-42-2
分子式 ：C20H40N4O10 ?2H2SO4 分子量 ：692.71
比鏇：+104o～+121o 水分：≤10% 吸光值：≤0.015 (280nm,1mg/ml), ≤0.1 (570nm, 100mg/ml)
效價： >700 ug/mg
[儲運] 室溫下運輸, 乾粉在室溫下儲存，溶液於-20℃儲存。
篩選
由於每種細胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細胞稀釋到1000個細胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度範圍內進行篩選，選擇出在10~14天內使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。
由於每種細胞對G418的敏感性不同，一般變動在100ug/ml～1000ug/ml範圍。在篩選之前，一定要確定細胞對這一批G418的最佳篩選濃度。儘管如此，特性明確的細胞系G418的最佳用量還是穩定的。《分子 克隆》給出了幾個常用細胞系所需G418的最佳用量。
由於 基因轉染到細胞內之後要一段時間才能表達出蛋白質。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉染了外源基因的細胞 代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出 陽性克隆，一般要在轉染24小時之後才開始加G418篩選。隨著細胞的代謝G418的濃度和活性都會下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降至200ug/ml。
加藥篩選約6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞寥寥無幾。這時會出現兩個問題：1.死亡的細胞會裂解釋放出有害物質，導致那些有neo表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡。2.孔中細胞數目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養液：假如你要轉染3T3細胞，在3T3細胞匯合度達到80%的時候，換液，培養過夜之後收集培養液，通過濾器消毒，和新鮮的培養液按1：1混合備用。再轉染後篩選過程中就可以套用這種培養基。
為了儘量減少陰性 克隆的死亡給 陽性克隆造成的不利影響以及增加 陽性克隆的得率，可以套用套環法或刮除法結合 有限稀釋法來篩選陽性 克隆。加藥後，在高倍鏡下， 陽性克隆和陰性克隆很容易辨認，在陽性克隆下用記號筆做個標記。然後刮除陰性克隆，消化 陽性克隆後繼續篩選培養；或者用套環套住陽性克隆，在套環內加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個新的孔中培養。最後再用 有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。
一般經過4周左右的篩選，得到的 陽性克隆都比較穩定。但是 外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。但是 外源基因整合到基因組中的 機率太小了，而且是隨機整合，會導致表達的目的蛋白的量產生很大差異。隨著培養時間的延續，那些丟失了 外源基因的細胞和很少表達目的基因的細胞會占據優勢，強表達目的蛋白的細胞會越來越少。這樣再次篩選是必不可少的。只有經過2次以上的篩選之後才能找到那種我們想要的強分泌目的蛋白的， 遺傳穩定的 細胞克隆。
