核酸片段長度凝膠電泳圖譜法
簡介
核酸既含有呈酸性的磷酸基團，又含有呈弱鹼性的鹼基，故為兩性電解質，可發生兩性解離。但磷酸的酸性較強，在核酸中除末端磷酸基團外，所有形成磷酸二酯鍵的磷酸基團仍可解離出一個H+，其pK為1.5；而嘌呤和嘧啶鹼基為含氮雜環，又有各種取代基，既有鹼性解離又有酸性解離的性質，解離情況複雜，但總的來看，它們呈弱鹼性。所以，核酸相當於多元酸，具有較強的酸性，當pK>4時，磷酸基團全部解離，呈多陰離子狀態。
核酸是具有較強的酸性的兩性電解質，其解離狀態隨溶液的pH而改變。當核酸分子的酸性解離和鹼性解離程度相等，所帶的正電荷與負電荷相等，即成為兩性離子，此時核酸溶液的pH就稱為等電點（isoelectricpoint,簡稱pI）。核酸的等電點較低，如酵母RNA的pI為2.0~2.8。根據核酸在等電點時溶解度最小的性質，把pH調至RNA的等電點，可使RNA從溶液中沉澱出來。
相關資料
根據核酸的解離性質，用中性或偏鹼性的緩衝液使核酸解離成陰離子，置於電場中便向陽極移動，這就是電泳（electrophoresis）。凝膠電泳可算是當前核酸研究中最常用的方法了。它有許多優點：簡單、快速、靈敏、成本低。常用的凝膠電泳有瓊脂糖（agarose）凝膠電泳和聚丙烯醯胺（polyacrylamide）凝膠電泳。可以在水平或垂直的電泳槽中進行。凝膠電泳兼有分子篩和電泳雙重效果，所以分離效率很高。
(一)瓊脂糖凝膠電泳
以瓊脂糖為支持物。電泳的遷移率決定於以下因素：
1.核酸分子大小遷移率與分子量對數成反比；
2.膠濃度遷移率與膠濃度成反比。常用1%膠分離DNA；
3．DNA的構象一般條件下超螺旋DNA的遷移率最快，線形DNA其次，開環形最慢。但在膠中加入過多的啡啶溴紅時，上述分布次序會發生改變；
4．電壓一般不大於5V／cm。在適當的電壓差時，遷移率與電流大小成正比；
5．鹼基組成有一定影響，但影響不大；
6．溫度4~30℃都可，常在室溫。
瓊脂糖凝膠電泳常用於分析DNA。由於瓊脂糖制品中往往帶有核糖核酸酶（RNase）雜質，所以用於分析RNA時，必須加入蛋白質變性劑，如甲醛等，以使核糖核酸酶變性。
電泳完畢後，將膠在螢光染料啡啶溴紅的水溶液中染色（0.5μg／ml）。啡啶溴紅為一扁平分子，很易插入DNA中的鹼基對之間。DNA與啡啶溴紅結合後，經紫外光照射，可發射出紅—橙色可見螢光。0.1μgDNA即可用此法檢出，所以此法十分靈敏。可根據螢光強度可以大體判斷DNA樣品的濃度。若在同一膠上加一已知濃度的DNA作參考，則所測得的樣品濃度更為準確。可以用靈敏度很高的負片將凝膠上所呈現的電泳圖譜在紫外光照射下拍攝下來，作進一步分析與長期保留。圖3-27即為凝膠電泳圖譜。
套用凝膠電泳可以正確地測定DNA片段的分子大小。實用的方法是在同一膠上加一已知分子量的樣品（如圖3-27中的λDNA／HindⅢ的片段）。電泳完畢後，經啡啶溴紅染色、照相，從照片上比較待測樣品中的DNA片段與標準樣品中的哪一條帶最接近，即可推算出未知樣品中各片段的大小。目前許多試劑公司都能提供各種不同分子量的標準樣品。凝膠上的樣品，還可以設法回收，以供進一步研究。回收的方法很多，可參考其他資料。最常用的方法是在紫外光照射下將膠上某一區帶切割下來，切下的膠條放在透析袋中，裝上電泳液，在水平電泳槽中進行電泳，使膠上的DNA釋放出來並進一步粘在透析袋內壁上，電泳3~4小時後，將電極倒轉，再通電30~60s，粘在壁上的DNA重又釋放到緩衝液中。取出透析袋內的緩衝液（丟棄膠條），用苯酚抽提1~2次，水相用乙醇沉澱。這樣回收的DNA純度很高，可供進一步進行限制酶分析、序列分析或作末端標記。回收率在50%以上。
（二）聚丙烯醯胺凝膠電泳
以聚丙烯醯胺作支持物。常用垂直板電泳。單體丙烯醯胺在加入交聯劑後，就成聚丙烯醯胺。由於這種凝膠的孔徑比瓊脂糖凝膠的要小，所以可用於分析分子量小於1000bp的DNA片段。聚丙烯醯胺中一般不含有RNase，所以可用於RNA的分析。但仍要留心緩衝液及其他器皿中所帶的RNase。
聚丙烯醯胺凝膠上的核酸樣品，經啡啶溴紅染色，在紫外光照射下，發出的螢光很弱，所以濃度很低的核酸樣品不能用此法檢測出來。
可以引起核酸變性的因素很多，如加熱、極端的pH、有機溶劑、醯胺、尿素等。由溫度升高而引起的變性稱熱變性。由酸鹼度改變引起的變性稱酸鹼變性。尿素是用聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定DNA序列常用的變性劑。甲醛也常用於瓊脂糖凝膠電泳法測定RNA的分子大小。
DNA變性的特點是爆發式的。當病毒或細菌DNA分子的溶液被緩慢加熱進行DNA變性時，溶液的紫外吸收值在到達某溫度時會突然迅速增加，並在一個很窄的溫度範圍內達到最高值。其紫外吸收增加40%，此時DNA變性發生並完成。DNA熱變性時，其紫外吸收值到達總增加值一半時的溫度，稱為DNA的變性溫度。由於DNA變性過程猶如金屬在熔點的熔解，所以DNA的變性溫度亦稱為該DNA的熔點或熔解溫度（meltingtemperature），用Tm表示。DNA的Tm值一般在70~85℃之間（圖3-29），常在0.15mol/LNaCI，0.015mol/L檸檬酸三鈉（sodiumchloride-sodiumcitrate,SSC）溶液中進行測定。
