黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因選擇系統
基本原理黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(XGPRT)是由大腸桿菌Eco-gpt基因編碼的一種核苷酸代謝酶。在哺乳動物細胞中沒有發現這種酶,但存在有它的類似物次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT)。XGPRT酶能夠有效地把黃嘌呤轉變為黃苷一磷酸(XMP),並最終形成鳥苷一磷酸(GMP)。而HGPRT酶則只能利用次黃嘌呤和鳥嘌呤為底物,並催化次黃嘌呤轉變為次黃苷一磷酸(IMP)。因此,根據這些特性,Eco-gpt基因可以作為哺乳動物基因轉移的一種顯性選擇標記。
霉酚酸(MPA)是一種IMP脫氫酶的抑制物,它能阻斷從IMP到XMP的轉變,從而也就阻斷了GMP的重新組合。氨基蝶呤同樣阻斷IMP的合成,把氨基蝶呤加到培養基中能更加有效地抑制GMP的重新合成。當在含有這兩種抑制物的抑制培養基中,同時還補加上鳥嘌呤和次黃嘌呤(或腺嘌呤),哺乳動物細胞照樣可以生長;因為補救代謝途徑中的次黃嘌嘌呤-鳥嘌噙磷酸核糖基轉移酶HGPRT,能夠把這些鹼基轉變為相應的單核苷酸,假如補加的是腺嘌呤和黃嘌呤,這種抑制作用就無法克服。這是因為哺乳動物的HGPRT酶不能夠把黃嘌呤轉變為XMP,所以無法合成GMP。然而,當哺乳動物細胞獲得了外源的Eco-gpt基因,並能有效地表達XGPRT的話,那么它們就能夠克服霉酚酸的氨甲蝶呤的抑制作用,並利用黃嘌呤合成XMP,並最終生成GMP,從而使細胞能夠在這種補加有黃嘌呤和腺嘌呤的抑制培養基中存活下來