模板
如上所述，有兩類DNA可以用作Sanger法測序的模板：純單鏈DNA和經過熱變性或鹼變性的雙鏈DNA。採用通常從重組M13噬菌體顆粒中分離得到的單鏈DNA應中獲得數百個核苷酸的序列。如用變性雙鏈DNA用模板，則較難獲得這咱質量的結果。儘管採用雙鏈DNA模板的方法顯然既簡單又方便（Chen和Seeburg，1985），然而只是在不久前得到改進以後，這一方法才發展到能夠獲得明確可信結果的水平。其中有兩個因素是至關重要的，這就是模板DNA的質量和所用DNA聚合酶的種類。小量制箅的質粒DNA常常被寡脫氧核糖核苷酸小分子、核糖苷酸及DNA聚合酶的抑制劑所污染，其中前兩種污染物可被用作隨機引物。結果，種種“鬼”帶、強終止現象，以及其他假象往往使測序凝膠含混不清、黯然失色。因此採用小量製備的質粒NDA來測定未知DNA克隆片段的序列，並不可取。然而,這類DNA常可作為對已經通過另一方法測定的序列進行進一步的合適模板。採用CsCl－溴化乙錠梯度平衡離心法來純化質粒DNA，測序的結果會好得多，但卻要耗費大量的人務和物力。模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。
３．DNA聚合酶
通常用於雙脫氧法序列測定的有幾種不同的酶，其中包括大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段（Sanger等，1977），反轉錄酶（見文獻，如Mieredorf和Prfeffer，1987）經過修飾消除了3'→5'外節酶活性的T7噬菌體DNA聚合酶（Sequenase）和測序酶2.0），Tabor和Richardson，1978]惟及從嗜熱水生菌（T'hermusaquaticus）分離的耐熱DNA聚合物（TaqDNA聚合酶）。這些酶的特性差別懸殊，因而可大大影響通過鏈終止反應所獲得的DNA序列的數量的質量。
1大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段這種酶是最初用以建立Sanger法的酶，也是至今仍然廣泛用於DNA序列測定的酶。通常碰到的兩個問題是：Koenow片段的持續合成能力低，以致一些片段並非由於ddNTP的摻入，而是因為聚合酸人模板上隨機解離而終止合成，因而導致背景增高。由於該酶不能沿模板進行長中距離移動，因此利用該酶進行的標準測序反應所得序列的長度有限。通常，這一反應只能得到大約250-350個核苷酸的序列。如果分兩步進行反應，所得序列的數目可以翻一番；其中第一步是初始標記步驟，採用低濃度的dNTP，而隨後的第二步是鏈延伸－鏈終止反應，含有ddNTP和高濃度的dNTP（Johoston-Dow等，1987;Stambaugh和Blakesley，1988）。然而即使有了這些改進，用Klenow酶所測序列的長度通常還是不如持續合成能力較強的測序酶。
2）這種酶對模板中的同聚核苷酸段或其他含牢固二級結構的區域進行複製的效能很低。將聚合反應的溫度提高到55℃，可以緩解但並不能徹底解決這一問題（Gomer和Firtel，1985)。有時可採用一些dNTP類似物[如dITP或7－脫氮dGTP（7－deaza-dGTP）]來獲取模板中可形成穩定二級結構的相應區段的序列信息，但Kleow酶對這些類似物的作用不如測序酶有效，這也許是因為它們使Klenow酶原已較低的持續合成能力進一步降低。總而言這，可以選用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段測定從引物5'位置起250個鹼基以內的一段DNA序列，但不宜用它來測定更長一段DNA序列或者具有二重對稱和（或）同聚核苷酸段的DNA序列。
（2）反轉錄酶
儘管日常測序工作並不廣泛使用反轉錄酶，但有時用這個酶解決一些由於模板DNA中存在A/T或G/C同聚核苷酸區而引起的問題。來自禽類和鼠類反轉錄病毒的反轉錄酶在這一看來要比Klenow酶略勝一籌（Karanthaansis，1982;Graham等,
相關詞條
參考連結
1、http://www.helixnet.cn/archiver/tid-2721.html
2、http://scitech.people.com.cn/GB/other2137/
3、http://book.sina.com.cn/nzt/spi/gongzuodna/
