基本描述
DNA的限制性內切酶酶切分析限制性內切酶能特異地結合於一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,並切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴於ATP的存在。Ⅰ類酶結合於識別位點並隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子,然後從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛套用，它們是重組DNA的基礎。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少數酶識別更長的序列或簡併序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位點在對稱軸一側,產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端, 如EcoRⅠ切割識別序列後產生兩個互補的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'
3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
DNA純度、緩衝液、溫度條件及限制性內切酶本身都會影響限制性內切酶的活性。大部分限制性內切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當微量的污染物進入限制性內切酶貯存液中時,會影響其進一步使用,因此在吸取限制性內切酶時,每次都要用新的吸管頭。如果採用兩種限制性內切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩衝液,則可同時水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內切酶必須首先使用,隨後調節鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內切酶水解。也可在第一個酶切反應完成後，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇，混勻後置-70℃低溫冰櫃30分鐘，離心、乾燥並重新溶於緩衝液後進行第二個酶切反應。
DNA限制性內切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內切酶酶切位點組成，以直線或環狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪製、DNA的無性繁殖、基因文庫的構建等工作中，建立限制性內切酶圖譜都是不可缺少的環節，近年來發展起來的RFLP(限制性片段長度多態性)技術更是建立在它的基礎上。
構建DNA限制性內切酶圖譜有許多方法。通常結合使用多種限制性內切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點及其相對位置。酶切圖譜的使用價值依賴於它的準確性和精確程度。
在酶切圖譜製作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA用量約為0.5-1μg。限制性內切酶的酶解反應最適條件各不相同,各種酶有其相應的酶切緩衝液和最適反應溫度(大多數為37℃)。對質粒DNA酶切反應而言, 限制性內切酶用量可按標準體系1μg DNA加1單位酶,消化1-2小時。但要完全酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反應時間也要適當延長。
瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種多聚多糖，是由D-半乳糖和L-半乳糖以α-1,3和β-1,4糖苷鍵相連形成的線狀高聚物。瓊脂糖遇冷水膨脹，溶於熱水成溶膠，冷卻後成為孔徑範圍從50nm到大於200nm的凝膠。
瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳是分離鑑定和純化DNA片段的標準方法。該技術操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當用低濃度的螢光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳後的凝膠中回收特定的DNA條帶,用於以後的克隆操作。
瓊脂糖和聚丙烯醯胺可以製成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小範圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從20000bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恆定的電場下電泳。聚丙烯醯胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯醯胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但製備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯醯胺凝膠採用垂直裝置進行電泳。目前,一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。
瓊脂糖主要在DNA製備電泳中作為一種固體支持基質,其密度取決於瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:
1、 DNA的分子大小:
線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難於在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。
2、 瓊脂糖濃度
一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關係。凝膠濃度的選擇取決於DNA分子的大小。分離小於0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大於10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間於兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、 DNA分子的構象
當DNA分子處於不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺鏇DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺鏇DNA移動最快,而線狀雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑑定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收,用同一種限制性內切酶分別水解,然後電泳,如在凝膠上出現相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。
4、 電源電壓
在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離範圍將縮小。要使大於2kb的DNA片段的解析度達到最大,所加電壓不得超過5v/cm。
5、嵌入染料的存在
螢光染料溴化乙啶用於檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的鹼基對之間並拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使其剛性更強,還會使線狀DNA遷移率降低15%。
6、 離子強度影響
電泳緩衝液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配製凝膠),電導率最小,DNA幾乎不移動,在高離子強度的緩衝液中(如誤加10×電泳緩衝液),則電導很高並明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。
對於天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩衝液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],tbe(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配製成濃縮母液,儲於室溫。
材料、設備及試劑
材料λDNA: 購買或自行提取純化; 重組pBS質料或pUC19質粒; EcoRI酶及其酶切緩衝液: 購買成品; HindⅢ酶及其酶切緩衝液: 購買成品;瓊脂糖(Agarose): 進口或國產的電泳用瓊脂糖均可。
設備水平式電泳裝置,電泳儀,台式高速離心機, 恆溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 照相支架, 照相機及其附屬檔案。
試劑1、 5×TBE電泳緩衝液：配方見第一章。
2、 6×電泳載樣緩衝液：0.25% 溴粉藍，40%(w/v) 蔗糖水溶液，貯存於 4℃。
3、 溴化乙錠(EB)溶液母液:將EB配製成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲於 室溫即可。
操作步驟
DNA酶切反應1、 將清潔乾燥並經滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號,用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應的限制性內切酶反應10×緩衝液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內溶液混勻後加入1μl酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關鍵,要防止錯加，漏加。使用限制性內切酶時應儘量減少其離開冰櫃的時間，以免活性降低。
2、 混勻反應體系後,將eppendorf管置於適當的支持物上（如插在泡沫塑膠板上）,37℃水浴保溫2-3小時,使酶切反應完全。
3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應,置於冰櫃中保存備用。
採用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段來作為電泳時的分子量標準。λDNA為長度約50kb的雙鏈DNA分子,其商品溶液濃度為0.5mg/ml,酶解反應操作如上述。HindIII切割 DNA後得到8個片段,長度分別為23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA後得到6個片段,長度 分別為21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。
瓊脂糖凝膠的製備1、 取5×TBE緩衝液20ml加水至200ml,配製成0.5×TBE稀釋緩衝液,待用。
2、 膠液的製備：稱取0.4g瓊脂糖,置於200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩衝液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8%瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動,使附於瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜,以減少水份蒸發。
3、 膠板的製備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置於水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳後再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側,待瓊脂糖溶液凝固後將剩餘的瓊脂糖小心地倒入膠槽內,使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現氣泡。待膠完全凝固後撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然後向槽內加入0.5×TBE稀釋緩衝液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩衝液進入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應注滿緩衝液。
4、 加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。
5、 電泳：加完樣後,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓保持在60-80V,電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時,停止電泳。
6、 染色：未加EB的膠板在電泳完畢後移入0.5μg/ml的EB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。
7、 觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色後的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色螢光條帶。紫光燈下觀察時應戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩,以免損傷眼睛。 經照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片後將相機固定於照相架上，採用全色膠片，光圈5.6,曝光時間10-120秒(根據螢光條帶的深淺選擇)。
8、 DNA分子量標準曲線的製作：在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點,用卡尺測量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。以核苷酸數的常用對數為縱坐標,以遷移距離為橫坐標,在坐標紙上繪出連結各點的平滑曲線,即為該電泳條件下DNA分子量的標準曲線。
9、 DNA酶切片段大小的測定：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離,根據此數值,在DNA分子量標準曲線上查出相應的對數值,進一步計算出各片段的分子量大小(若用單對數坐標紙來繪製標準曲線,則可根據遷移距離直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由標準曲線上查出它預計的遷移距離。
10、 DNA酶切片段排列順序的確定：根據單酶切,雙酶切和多酶切的電泳分析結果,對照DNA酶切片段大小的數據進行邏輯推理,然後確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點的相對位置。以環狀圖或直線圖表示,即成該DNA分子的限制性內切酶圖譜。
[注意]
1.酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應。
2、酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應條件下，1小時完全降解1mg lDNA的酶量為一個單位，但是許多實驗製備的DNA不象lDNA那樣易於降解，需適當增加酶的使用量。反應液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質可能幹擾隨後的反應。
3、市場銷售的酶一般濃度很大，為節約起見，使用時可事先用酶反應緩衝液（1×）進行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應將反應液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。
4、 觀察DNA離不開紫外透射儀,可是紫外光對DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時,應儘量縮短光照時間並採用長波長紫外燈(300-360nm）,以減少紫外光切割DNA。
5、 EB是強誘變劑並有中等毒性,配製和使用時都應戴手套,並且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經專門處理後才能清洗或丟棄。
6、 當EB太多,膠染色過深,DNA帶看不清時,可將膠放入蒸餾水沖泡,30分鐘後再觀察。
