固相雜交
簡介
目的建立簡便，快速的C型肝炎病毒基因擴增產物的固相雜交檢測方法。方法將標記有生物素的寡核引物擴增的C肝病毒基因產物，與通過結合在微孔反應板上的特異性探針進行快速雜交，然後通過辣根過氧化物酶標記的抗生物素進行酶聯顯色。讀取光密度值。結果套用本方法對血清中C型肝炎病毒核酸檢測，靈敏度可達５拷貝～５０拷貝／反應。結論此方法簡便，快速，特異性好，敏感性高，結果判定指標客觀
相關資料
雜交反應的條件類似於傳統的Southern或Northern雜交。具體的選擇視研究目的而定，例如，進行多態性分析或雜交測序時，要求能夠區分單個鹼基的變異，所以需要較高的雜交嚴謹性；而用於表達譜檢測的晶片為了提高檢測的特異性、保證較高的靈敏度，需要較長的雜交時間，高的嚴謹性、高的樣品濃度、較低的雜交溫度等。同時，雜交反應還必需考慮反應液中的鹽濃度、探針序列的G+C含量、探針所帶電荷情況、探針與晶片片基間連線臂的長度及種類，靶序列二級結構等因素[1]。固定於晶片表面的探針或蛋白、多肽分子與位於液相的靶分子進行生化反應（作用）的過程不完全與液相中生化反應相同。其原因在於，生物大分子與固相支持物的結合導致了溶液中的靶分子與其不能迅速地發生作用，延長了反應時間，必要時還必需提高靶分子的濃度以加快反應。而且，固相化的大分子，特別是空間體積較小的分子，很容易受到支持物對生化反應的空間阻礙作用。如何解決以上問題是生物晶片技術套用中的關鍵之一。有研究表明[2,3]，在探針分子與片基間加入適當長度的連線臂可使雜交效率提高上百倍。連線臂將固相化的探針分子與支持物隔開一定的距離，減少空間阻礙作用。另外，不帶電荷的肽核酸(PNA)也可與DNA形成PNA-DNA雜交體，且比DNA-DNA或DNA-RNA雜交體更為穩定的，防止核酸二級結構對雜交反應的影響，所以適合進行單個鹼基錯配的分析。PNA還能夠抵禦蛋白酶與核酸酶的降解，具有很高的穩定性[4]。目前由於PNA合成難度較大、成本高尚未得到大量的套用。為加快雜交反應速度，美國Nanogen公司研製的電子晶片通過在雜交位點引如電場而使雜交和沖洗過程速度大大增加。它在1mm2的位點上製作有微電極陣列（圖1.），其上覆以鏈親和素標記的瓊脂糖[5,6]。生物素標記的探針分子可快速地結合到位於電極上方的瓊脂糖上，從而提高了雜交速度。其原理為:當位於待檢位點鏈親和素標記的瓊脂糖凝膠下方的微電極引入直流正電壓後，溶液中的生物素標記化的探針就可在電場的作用下快速泳動並濃縮結合於該處。同樣的道理，可以使待檢的DNA分子快速濃縮於此，從而有力地雜交反應迅速進行。雜交完成後，改變電場方向、可將未雜交的樣品DNA從檢測位點“洗”去，選擇適當的電場強度就可以使非特異雜交的DNA與未雜交的探針選擇性地從特定位點分開除去，而保留完全雜交的DNA分子。由於電場的這種濃縮和選擇特性，使得該方法有很高的靈敏度和特異性，最重要的是它使原來數小時的雜交反應縮短到二三十秒鐘[7]。GeneLogic公司研製的生物晶片將探針分子固定與微通道內，標記後的核酸樣品流過時便會濃縮富集於通道內，同樣也可縮短雜交過程，提高檢測的靈敏度，降低試劑消耗[8,9]。
