RNAi的定義
目前對RNAi (RNA interference)的定義有很多種，不同的資料對其定義的側重點也不盡相同，如果將RNAi看作一種生物學現象，可以有以下定義：① RNAi是由dsRNA介導的由特定酶參與的特異性基因沉默現象,它在轉錄水平、轉錄後水平和翻譯水平上阻斷基因的表達。② RNAi是有dsRNA參與指導的，以外源和內源mRNA為降解目標的轉基因沉默現象。具有核苷酸序列特異性的自我防禦機制，是一種當外源基因導入或病毒入侵後，細胞中與轉基因或入侵病毒RNA同源的基因發生共同基因沉默的現象。
如果將其作為一門生物技術，則定義為：① RNAi 是指通過反義RNA與正鏈RNA 形成雙鏈RNA 特異性地抑制靶基因的現象,它通過人為地引入與內源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(有義RNA 和反義RNA) ,從而誘導內源靶基因的mRNA 降解,達到阻止基因表達的目的。② RNAi是指體外人工合成的或體內的雙鏈RNA（dsRNA）在細胞內特異性的將與之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相應的基因沉默。③ RNAi是將與靶基因的mRNA 同源互補的雙鏈RNA(dsRNA ) 導入細胞,能特異性地降解該mRNA ,從而產生相應的功能表型缺失, 屬於轉錄後水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。
各種不同定義雖然說法不同，但所描述事實是大體相同的，簡單地可以說，RNAi就是指由RNA介導的基因沉默現象。
原理
最近由於RNA干擾（RNA interference，RNAi）的發現使反義領域的研究增多。這種自然發生的現象最早是在秀麗線蟲中發現的（1），是序列特異性地使轉錄後的基因沉默的有力機制。由於最近兩年在RNAi領域取得的進步，已經有許多這方面的綜述發表（2-4）。RNA干擾是由長的雙鏈RNA分子發動的，該分子可以被Dicer enzyme加工成長度為21-23個核苷酸的RNA（見圖）。RNaseIII蛋白被認為是作為一個二聚體發揮作用，它對雙鏈RNA的兩個鏈都進行切割，酶切的產物3'末端互相重疊。然後這種小的干擾RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）摻入RNA誘導的沉默複合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引導核酸酶降解靶RNA。這種保守的生化機制可用於研究多種模式生物的基因功能，但是它在哺乳動物細胞中的套用受到阻礙，因為長的雙鏈RNA分子會引起干擾素應答。因此Tuschi及其同事表明長度為21nt的siRNA可以特異性的抑制哺乳動物細胞基因表達是一個革命性的突破（5）。這個發現激發了大量利用RNAi技術對哺乳動物細胞的研究，因為與傳統的反義技術比，RNAi的性能明顯較高。
有趣的是，除了短雙鏈RNA，短髮夾RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如莖環結構在細胞內經過加工後也可以變成siRNA，從而產生RNA干擾（6、7）。這使得構建表達干擾RNA的載體，從而使哺乳動物細胞內基因表達長期沉默成為可能（4、8）。shRNA可以利用RNA聚核酶III啟動子轉錄，在正常情況下，該啟動子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的組分H1 RNA（11）轉錄的。另外一種辦法是兩段短RNA分子分別用U6啟動子轉錄出來（6、12、13）。載體介導的siRNA表達使對功能缺失（loss-of-function）表型進行長期分析成為可能。在穩定轉染的細胞內，兩個月後仍可觀察到沉默現象（11）。
另外一種延長siRNA抑制基因表達時間的方法是對化學合成的RNA進行核苷酸修飾。儘管未經修飾的短雙鏈RNA在細胞培養物或者體內的穩定性出乎意料的高，然而有些情況下，需要對siRNA的穩定性進行進一步提高。因此，可以在兩條鏈的末端都引入經過修飾的核苷（14）。一個5'端為兩個2'-O-甲基RNA、3'端為4個甲基化核苷的siRNA與序列相同但是未經修飾的siRNA比活性相同，但是在細胞培養物中引起的基因沉默現象的時間延長。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入體積較大的烯丙基將導致siRNA活性下降。
RNA干擾在哺乳動物體內的第一個研究是利用快速注射大量生理溶液的方法將一個編碼shRNA的質粒注入老鼠的尾靜脈（15、16）。在大多數器官中，報導基因（編碼於共轉染質粒或者轉基因小鼠上）的表達可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作為肝損傷治療相關的內源靶標進行了RNA干擾實驗（17）。注射siRNA之後，小鼠肝細胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保護小鼠免遭由注射競爭性Fas特異抗體引起的爆發性肝炎，82%用siRNA處理的小鼠活過了10天觀察期，而所有的對照小鼠在3天之內死亡。
上述研究中採用的高壓導入技術是一種粗暴的方法，不適於治療用。因此，標準的基因治療所採用的方法被用於RNA干擾。一個反轉錄病毒載體被用於導入siRNA，以抑制人類胰腺腫瘤細胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。負調控癌細胞中K-ras基因的表達使得它們在注入無胸腺的裸鼠皮下之後不再具有形成腫瘤的能力。這項研究還表明siRNA的高度特異性，因為只有癌基因K-ras被沉默，而與之只有1個鹼基對差異的野生型等位基因並沒有被沉默。另外，當在紋狀區注射表達siRNA的腺病毒之後，轉基因小鼠大腦中GFP基因的表達可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通過在小鼠尾靜脈注射重組腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV啟動子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表達元件被用於這個實驗，為設計組織特異性或者可誘導的siRNA載體打開了大門。
總的來說，siRNA的第一個體內實驗已經進行，其他有重要意義的基因有望於很快作為靶標開展研究。至今為止的研究沒有觀察到任何套用siRNA引起的毒性作用，但是在治療人類疾病的臨床試驗開始之前仍需小心，以排除長期使用RNA干擾引起的嚴重副作用。因為用siRNA使基因表達沉默與傳統的反義技術相似，研究者將從十多年來反義技術研究的教訓中獲益，比如需要使用合適的對照以證明基因表達的敲除是特異性的，以及對免疫系統可能引起的意外影響進行詳細分析。
套用
siRNA可用於研究基因的功能，可是後基因組時代的今天，研究人員已經不滿足於一個一個基因沉默這樣的研究節奏了，功能基因組學的研究更需要一個能站在全局高度研究多個基因之間關係的工具，因此，用作大規模RNA干擾用的shRNA/siRNA文庫應運而生。shRNA/siRNA文庫聯合使用高通量篩選技術和高內涵圖像分析技術，使得RNAi篩選在反向基因組學、功能基因研究、藥物發現等多個領域成為了一個強大的套用工具。北京賽諾亞生物技術有限責任公司（http://www.sirnoa.com/）是一家擁有獨立自主產權的、以RNAi篩選的相關產品和技術服務為重點生物高新技術企業。公司專業從事各種高通量miRNA檢測、RNA干擾篩選、藥物篩選、文庫篩選及相關產品的研發和銷售，同時提供進行各種RNAi相關的載體構建、病毒包裝服務和細胞生物學試劑。公司致力於為從事生命科學研究和早期藥物研發的科研人員提供一站式的RNA干擾相關服務。
