概述
mRNA差別顯示技術也稱為差示反轉錄PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）簡稱為ddRT-PCR。它是將mRNA反轉錄技術與PCR技術二者相互結合發展起來的一種RNA指紋圖譜技術。目前已廣泛套用於分離鑑定組織特異性表達的基因。差別基因表達（differential gene express）是細胞分化的基礎。mRNA差別顯示技術正是對組織特異性表達的基因進行分離的一種快速而行之有效的方法。該方法的基本原理是首先選取不同的組織樣品或不同發育階段的同一組織樣品或同一組織樣品經不同藥物處理誘導的樣品，經總RNA提取後，進行mRNA反轉錄合成cDNA。此cDNA的合成是採用Oligo（dT）12 MN為引物，其中M為A，C，G中的任意一種，N為A，C，G或T中的任意一種，所以共有12種oligo（dT）12 MN引物，其中M稱為錨定鹼基，起增大引物Tm值的作用，N稱為分類鹼基，對反轉錄進行分類。用這12種引物分別對同一總RNA樣品進行cDNA合成，即進行12次不同的反轉錄反應，從而使反轉錄的cDNA具有12種類型，也就是對cDNA進行12種歸類（目前較為流行的方法是進行4種歸類，即M為簡併鹼基的形式存在），在此基礎上對每一類cDNA進行隨機引物和反轉錄引物PCR擴增，通過對組織樣品的同一類cDNA的PCR選擇性擴增產物凝膠電泳分析，從而反映出不同樣品間基因的時間和空間上組織特異性的表達。如此眾多種類的mRNA反轉錄產物經PCR選擇擴增後其類型依然為數眾多，很難用電泳系統加以快速準確地分離。因而需要對反轉錄產物cDNA進行歸類處理，減輕不同PCR產物電泳分離的難度，提高分離的準確率。（見示意圖）
實驗流程
| 對照組的總RNA提取 mRNA完整性鑑定 | 實驗組的總RNA提取 mRNA完整性鑑定 | |
| ↓ ↓ | ||
| 錨定引物逆轉錄成cDNA | 錨定引物逆轉錄成cDNA | |
| ↓ ↓ | ||
| 採用隨機引物和逆轉錄引物進行選擇性PCR擴增 | 採用隨機引物和逆轉錄引物進行選擇性PCR擴增 | |
↓ ↓
| 擴增產物進行凝膠電泳分析 |
| 差異性條帶的回收與第二次擴增 |
| Northern雜交，Southern雜交再次確定差異性條帶的真實性 |
| 差異性條帶的克隆、測序、分析，DNA及胺基酸序列在線上檢索 |
| 以差異性條帶為探針克隆出基因組文庫中的基因 序列及cDNA文庫中的全長cDNA序列 |
| 基因功能的鑑定： ①knock out ②dominant negative mutation ③原核系統或真核系統中的表達翻譯。抗體的制 備，細胞內的定位，抗體抑活等等。 ④one hybrid判斷出該基因的“啟動”基因。 ⑤two hybrid判斷出該基因的產物的作用途徑。 |
這裡以CLONTECH公司生產的DeltaTMDifferential Display Kit為例，介紹具體的實驗步驟。該試劑盒中含有10種任意引物和9種Oligo(dT)引物。
操作步驟
1．總RNA的提取（見Northern 雜交）
2．第一鏈合成：
(1)總RNA樣品 2μg；cDNA合成引物 1μl；加ddH2O補至5μl。將管標號為1A,2A,PC A等。PC為陽性對照。
(2)混勻後稍離心。
(3）70℃孵育3min，冰浴2min後稍離心。
(4）準備dNTPmix (以5管為例 )
每管 5管
5×第一鏈緩衝液 2μl 10μl
dNTPmix（各5mM） 2μl 10μl
MMLV逆轉錄酶（200u/μl） 1μl 5μl
5μl 25μl
(5）每管加入5μl，混勻後稍離心。
(6）42℃孵育1hr。
(7）75℃ 10min終止反應後置冰上，稍離心。
(8)將2μl反應液分別轉至新管中（新管標號為1B,2B,PC B等）。
(9) 將78μl ddH2O分別加入B管中,混勻。
(10)將72μl ddH2O分別加入A管中，混勻。
(11）將所有cDNA稀釋液 -20℃保存待用。
3．dd-PCR: 以 引物P1,T9為例說明
（0.5ml PCR管,1代表對照組,2代表實驗組）
管號 cDNA樣品 引物
(1) 1A P1,T9
(2) 1B P1,T9
(3) 2A P1,T9
(4) 2B P1,T9
(5) H2O P1,T9
(6) RNA1 P1,T9
(7) RNA2 P1,T9
以下為陽性對照反應體系
(8) PC 1A P10,T8
(9) PC 1B P10,T8
(10) PC 2A P10,T8
(11) PC 2B P10,T8
(12) H2O P10,T8
(13) PC RNA1 P10,T8
(14) PC RNA2 P10,T8
在PCR 管中加入:
① cDNA樣品 1μl
P引物 1μl
T 引物 1μl
② 準備其它PCR試劑的混合液: (在另一管中加入)
成分 每管(μl) 所需管數( n=14)
10×buffer 2.0 2n
ddH2O 14.0 14n
dNTPmix 0.2 0.2n
α-P dATP 0.4 0.4n
Taq酶 0.4 0.4n
終體積 17.0 17 n
混勻後稍離心。
③ 將17μlPCR混合液加入各反應管，則各管總體積為20μl。
④ 開始PCR擴增。
⑤PCR循環參數：
在GeneAmpPCR Systems 2400 & 9600 擴增儀上執行以下程式：
94℃ 5min
1 cycles 40℃ 5min
68℃ 5min
94℃ 30sec
2 cycles 40℃ 30sec
68℃ 5min
94℃ 20sec
23 cycles 40℃ 30sec
68℃ 2min
1 cycles 68℃ 7 min。
⑥ 反應結束後置-20℃保存備用。
4．電泳和放射自顯影
(1）配製6%變性聚丙烯醯胺凝膠，灌注測序板。
(2）預電泳30min。
(3）每個dd-PCR反應取出5μl於一新微量離心管中，加5μl loading
buffer，混勻，離心，置94℃變性2min。立即置冰浴。
(4)停止預電泳，沖洗加樣孔。
(5)加樣2μl。70W電泳2.75hr至二甲苯青到達膠的底部。
(6）下膠：（同測序膠）
(7）乾膠：在膠表面覆上保鮮膜，80℃乾膠30min。
(8)X光片-70℃曝光過夜或更長時間(根據射線強度而定)。
圖2-6顯示了dd-PCR放射自顯影的X光片
5．差異條帶回收再擴增
(1）X光片經D72顯影、酸性定影液定影后，水洗晾乾。置X光片燈上比較尋找差異條帶。
用一次性手術刀片在膠上切割差異條帶，加ddH2O 20μl，沸水浴15min，離心取上清為模板。(3) 以原引物擴增：
回收DNA 7 μl
10×PCR buffer 5 μl
5mM dNTPmix 0.5 μl
引物P 2.5 μl
引物T 2.5 μl
Taq酶 2 μl
加ddH2O至總體積為50μl
執行PCR程式: 93℃3min；93℃1min→60℃1min→68℃2min，20次循環；68℃5min。
取PCR產物10μl 2%瓊脂糖電泳檢測。PCR產物乙醇沉澱，10μlddH2O溶解。6．以PCR產物為探針，標記後進行Northern雜交，證實基因的真實性。
7．PCR產物的TA克隆。
8．DNA序列測定。
9．檢索分析。
