猜測體
猜測體:一種人工合成的用於分離克隆基因的低簡併性的寡核苷酸探針,其核苷酸序列是根據特定物種當中某種已知蛋白質的密碼子使用頻率,同時又採納了根據猜測最可能在目的基因中出現的密碼子資料,選擇含有密碼子簡併程度最低的蛋白質區段進行合成.
一種較長的唯一的寡核苷酸序列,它能夠大範圍的卻不能夠完全的同靶序列互補.
PCR-猜測體探針
(尿酸氧化酶基因)
根據末端32個胺基酸序列,設計
PCR簡併引物,以cDNA為模板
用猜測探針雜交篩選陽性克隆
套用差別雜交或扣除雜交法
分離克隆的目的基因
差別雜交(differentialhybridization)
又稱差別篩選(differentialscreening)
適用於分離經特殊處理而被誘發表達的mRNA的cDNA.
扣除雜交(subtractivehybridization)
又叫扣除cDNA克隆(subtractivecDNAcloning)
通過構建扣除文庫得以實現.
差別雜交:
需要兩種不同的細胞群體(目的基因正常表達,目的基因不表達),分別製備兩種不同mRNA提取物,以兩種總mRNA探針平行雜交,對有表達目的基因的細胞總mRNA構建的克隆文庫進行篩選.
差別雜交的局限性:
1.雜交靈敏度低,對於低峰度的mRNA尤為明顯
2.工作量大,重複性差,兩套平行濾膜之間的DNA保有量有差別,導致雜交信號不一致.
扣除雜交:
去除普遍共同存在的,或是非誘發產生的cDNA序列,從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集.
套用mRNA差別顯示技術(DDRT-PCR)
分離克隆的目的基因
(differentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction)
原理:
用3'-端錨定引物和反轉錄酶合成cDNA的第一鏈;用3'-端錨定引物和5'-端10-mer隨機引物組成引物對,以反轉錄第一鏈為模板進行PCR擴增(DDRT-PCR),在標準的序列膠中電泳2~3小時,可顯示出50~100條長度在100~5000bp之間的DNA條帶.
3'-錨定引物:
P.Liang等人設計合成了全部12種不同的引物,用以反轉錄mRNA,合成第一鏈cDNA.這種引物通常叫作3'-端錨定脫氧核苷酸引物,並用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示.其中M為除了T以外的任何一種核苷酸(即A,G或C),而N則為任何一種核苷酸(即A,G,C或T),故MN共有12種不同的排列組合方式.
mRNA:5'-NMAAAAAA…AA-3'(12種序列)
3'-NMTTTTTTT…TT-5'
5'-隨機引物:
10-mer,更好的同第一鏈結合,從而呈現出更多種的mRNA.一般用20種隨機引物和12種3'-端錨定引物組成的全部240組引物對PCR擴增後,所產生的大約20000條條帶,基本涵蓋了在一定的發育階段某種類型細胞中所表達的全部的mRNA.
DDRT-PCR(mRNAdifferentialdisplyreversetranscriptionpolymerasechainreaction)
由於在cDNA群體中,代表特定細胞類型或發育階段的mRNA的含量非常低,所以要把一種只在某一階段或某種細胞類型中表達,而在另一發育階段或某種細胞類型中不表達的目的基因分離出來,就需要PCR擴增.
基本過程:
1.從一對處於不同發育階段(或不同基因型)
的細胞群體中分離總mRNA,並用3'-端錨定引物作反轉錄合成第一鏈cDNA;
2.用5'-端隨機引物和3'-端錨定引物組成的引物對,在加入放射性同位素標記的dNTP的條件下,以第一步反轉錄產物作模板進行PCR擴增.
3.將擴增樣品在變性的DNA測序膠中進行電泳分離;
4.將有關的差別表達的DNA條帶從測序膠上切割下來回收其DNA片斷;
5.膠塊中的DNA量非常少,不能用於克隆,需進行二次擴增;
6.將克隆的特定的DNA分別同基因組DNA及總mRNA作Southern或Northern雜交,測序;
7.以此目的片斷作探針從cDNA文庫中或基因組文庫中篩選全長的cDNA克隆或基因組克隆.
優點:
1.可以同時比較多個樣品表達的差異;
2.可以同時檢測"上游"及"下游"的基因;
3.檢測靈敏度高,所需樣品少,經PCR擴增一些低峰度的mRNA也可以被檢測出來;
4.結合使用了PCR和序列膠電泳分析兩項技術,使本方法顯得較單方便.
局限性:
1.假陽性比例高(50%～75%);
同一長度的條帶,含有多種DNA序列;鄰近條帶回收時,造成人為誤差;
mRNA3'-端序列保守性高,而常用3'-端cDNA作探針.
2.擴增的差別條帶分子長度比較短小(110～450bp);
套用表達文庫
分離克隆的目的基因
表達文庫分離克隆的目的基因
當沒有可用的核苷酸序列供作篩選基因文庫的探針時,將cDNA克隆在表達載體上,再導入大腸桿菌寄主細胞然後通過對蛋白質產物的鑑定,分離克隆的真核目的基因.
特點:
1.表達的蛋白質以融合蛋白質的形式存在,其中原核蛋白質的胺基酸序列是整合在真核蛋白質的一個末端,不易被原核細胞中的有關蛋白酶消化降解,因而顯得比較穩定,可以得到較高的表達水平.
2.cDNA片斷必須置於啟動子序列下游,在其控制之下;按正確的取向和讀碼結構插入,確保產生正確的蛋白質.
篩選的方法:
1.利用抗體篩選表達文庫;
2.測定蛋白質的功能;
3.用放射性同位素標記的,帶有特定蛋白質結合位點的DNA片斷作探針篩選表達文庫.
將菌落或噬菌斑原位複製到膜上
處理之後蛋白質暴露,與第一抗體溫育
漂洗未結合的抗體,加入經標記的第二抗體
能與第一抗體結合
抗體篩選表達文庫
2.測定蛋白質的功能
生物化學研究表明,存在Ca++離子的條件下,鈣調蛋白能與許多種酶結合形成穩定的複合物.
將放射性同位素標記得鈣調蛋白用作探針篩選cDNA表達文庫,鑑定能夠表達出與它特異性結合的目標蛋白質的陽性克隆.
3.用放射性同位素標記的,帶有特定蛋白質結合位點的DNA片斷作探針篩選表達文庫
鑑定能夠表達出與特定DNA片斷(真核啟動子中與轉錄因子結合的DNA元件)結合的目標蛋白質的克隆.
酵母雙雜交體系
(two-hybridsystem)
酵母雙雜交體系又叫相互作用陷阱
(interactiontrap)
有效的分離能與已知的靶蛋白質相互作用的蛋白質的編碼基因.
套用於真核基因地表達調控,細胞粘合因子間的相互作用,信號轉導通路以及細胞周期與分化,反式因子的鑑定與分離等研究
基本原理:
許多真核生物的轉錄激活因子都是由兩個結構上可以分開的,功能上相互獨立的結構域組成(example);
套用重組DNA技術,也可以將來自同一個轉錄因子的,或者兩種不同轉錄因子的,分開的兩種結構域,在體內重新組裝成具有功能的轉錄因子,從而激活UAS(上游激活序列)下游啟動子調節的報告基因的表達.
Example:
釀酒酵母的半乳糖苷酶基因的轉錄激活因子GAL4,在N端1～147位胺基酸區段有一個結合域(DNA-bindingdomain,DNA-BD);在C端768～881位胺基酸區段有一個轉錄激活域(transcriptionactivationdomain,AD)DNA-BD能識別激活序列並與之結合;AD通過同轉錄機制中的其它成份之間的結合作用啟動下游基因進行轉錄.
用DNA重組技術將它們分開,即使在同一個寄主中表達,也不會直接發生相互作用不能激活相關的效應基因進行轉錄.
寄主菌株:剔除掉GAL4基因的釀酒酵母
1.SFY526和HF7c帶有報告基因lacZ,HIS3和LEU2
2.還有兩種可以在大腸桿菌和酵母中自主複製的穿梭載體
a.pGBT9(DNA-BD):靶基因是按正確的取向和讀碼結構被克隆在載體的多克隆位點區內,於是靶蛋白和GAL4-BD之間產生融合作用,形成雜種蛋白質
b.第二種質粒載體pGAD424(AD質粒載體)用來構建cDNA表達文庫專用載體,克隆cDNA片斷是按正確的取向和讀碼結構插入在載體的多克隆位點區內,因此由cDNA編碼的蛋白質便會同GSL4-AD之間產生融合作用,形成雜種蛋白質.
酵母雙雜交體系的主要實驗過程:
a.選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c;
b.構建帶有GAL1UAS-啟動子-lacZ(His3)的轉化載體;
c.把已知的靶蛋白質編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點上,把所有cDNA都克隆到pGAD424載體上,構成cDNA表達文庫.
d.從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質粒DNA,共轉化感受態釀酒酵母菌株.
e.將共轉化的酵母菌株塗布於缺少Leu,Trp和His的培養基上,篩選表達相互作用的雜種蛋白的陽性菌落.
重組子分子的選擇與鑑定
1.遺傳檢測法
2.物理檢測法
3.菌落或噬菌斑雜交篩選法
4.免疫化學檢測法
5.蛋白質篩選法
6.轉譯篩選法
遺傳檢測法
該方法要求克隆基因能夠表達,並利用相應的基因突變型作為受體細胞,當受體細胞由突變型變為野生型時或賦予受體細胞特定的表型時,我們基本可以確定所克隆的基因是否是目的基因.
優點:簡便,快速,結果較可靠.
缺點:基因必須表達並具有合適的受體
細胞.
1.根據載體表型特徵選擇重組體分子的直接選擇法
a.抗藥性記號插入失活選擇法
b.β-半乳糖苷酶顯色反應選擇法
2.根據插入序列的表型特徵選擇重組體分子的直接選擇法
轉化進來的外源DNA編碼的基因,能夠對大腸桿菌寄主菌株所具有的突變體發生體內抑制或互補效應,從而使被轉化的寄主細胞表現出外源基因編碼的表型特徵.
Example:
λgt.λB噬菌體(由於C片斷的缺失而造成重組缺陷的λred-噬菌體),在大腸桿菌ligts菌株上生長不能形成噬菌斑,在有連線酶功能的大腸桿菌lig+菌株上形成噬菌斑.
將具有連線酶基因的重組體噬菌體λgt.λB,塗布在大腸桿菌ligts菌株上時,通過寄主細胞的互補作用,能夠形成噬菌斑.根據形成噬菌斑這種表型特徵,直接選擇具野生功能的重組體噬菌體.
缺點:
不單要求克隆的DNA片斷必須大到括足以包含一個完整的基因,而且還要求所編碼的基因能夠在大腸桿菌中實現功能表達.
(對於真核基因很難達到要求)
物理檢測法
1.凝膠電泳檢測法
利用凝膠電泳的方法,鑑定外源片斷是否插入及其長度.
優點:簡便,快速.
缺點:只能提供克隆片段大小的信息.
2.R-環檢測法:鑑定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源區域
在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度的甲醯胺溶液中(70%),雙鏈的DNA-RNA分子比雙鏈的DNA-DNA分子更加穩定.
在這種條件下,RNA會同它的雙鏈DNA分子中的互補序列退火形成穩定的RNA-DNA,而被取代的另一條DNA呈單鏈狀態.這種由雙鏈RNA-DNA和單鏈DNA形成的泡狀體稱R-環結構.
分子雜交技術檢測法
包括菌落或噬菌斑的原位雜交技術.
優點:方法簡便,快速.
缺點:必須具有相應的探針.
免疫化學檢測法
利用免疫學的原理,檢測克隆基因的表達產物.
1.放射性抗體檢測法
該方法類似於原位雜交法.
優點:方法簡便,一次可檢測大量的
克隆子.
缺點:克隆基因必須表達並具有相應的
抗體.
原理:
1.免疫血清含有幾種IgG抗體,識別抗原分子上不同定子,並分別同各自識別的抗原定子相結合;
2.抗體分子或抗體的F(ab)部分,能夠牢固的吸附在固體基質上(聚乙烯等塑膠製品),而不容易被洗脫掉;
3.通過體外碘化作用,IgG抗體會迅速的被放射性同位素125I標記上.
步驟:
1.菌落溶解釋放出抗原蛋白質;
a.把平板放置在氯仿蒸氣中;
b.用烈性噬菌體的氣溶膠噴灑;
c.用帶有能被熱誘發的原噬菌體的寄主菌處理.
2.將連結在固體支持物上的抗體緩慢的同溶解的細胞接觸,形成抗原-抗體複合物
3.將固體支持物取出,與放射性標記的第二種抗體溫育;
4.放射自顯影檢測.
細菌菌落溶解,釋放出抗原蛋白質
雙位點檢測法:
適用於含有雜種多肽菌落分析.
雜種多肽A–B
(A)抗體(B)抗體
固定在固體基質125I標記
濾膜
抗體溶液
放射性標記抗體檢測法的操作程式
聚乙烯薄膜
培養皿及菌落
放射性標記抗體檢測法的操作程式
2.免疫沉澱檢測法
在生長菌落的瓊脂培養基中,加入專門抗這種蛋白質分子的特異性抗體.如果菌落的細菌會分泌出某種蛋白質,那么它的周圍,就會出現一條由一種叫做沉澱素的抗體-抗原沉澱物所形成的白色的圓圈.
靈敏度低,易受干擾,實用性差.
3.表達載體產物之免疫化學檢測法
用專門設計的表達載體,將真核基因編碼的蛋白質在大腸桿菌中實現表達,通過免疫化學法進行檢測.
蛋白質篩選法
用來檢測同DNA特異性結合的蛋白質因子的一種方法.
操作程式:
1.用硝酸纖維素濾膜進行"噬菌斑轉移",使其中的蛋白質吸附在濾膜上;
2.將濾膜同放射性標記的含有DNA結合蛋白質編碼序列的雙鏈DNA寡核苷酸探針雜交;
3.根據放射自顯影結果篩選出陽性反應克隆.
轉譯篩選法
1.雜交抑制的轉譯
該方法用於cDNA文庫中目的基因的篩選.其原理是在體外無細胞的轉譯中利用cDNA與mRNA雜交後導致mRNA的不能翻譯,從而篩選陽性克隆子.
分離的基因編碼著豐富的mRNA.
優點:不需要克隆基因的表達,不需要探針或抗體.
缺點:較煩瑣.
步驟:
1.將從大腸桿菌菌落或噬菌體群體中製備的帶有目的基因的重組質粒DNA變性後,與總mRNA雜交;
2.轉入無細胞轉譯體系(麥胚提取物或兔網織紅細胞提取物),由於加有35S標記的蛋氨酸,轉譯的多肽蛋白質可以通過聚丙烯醯胺凝膠電泳和放射自顯影進行分析;
3.結果同未雜交的mRNA轉譯產物作比較,從中找出其轉譯合成被抑制的mRNA,即同目的基因變性DNA互補彼此雜交的mRNA.
2.雜交選擇的轉譯
是一種直接的選擇法,比雜交抑制的轉譯要敏感得多,而且還可適用於低峰度的mRNA之cDNA重組分子的檢測.
