預成抗體
評價新型抗體靶向基因導入系統及其核心組分：葡萄球菌A蛋白多聚賴氨酸交聯物(SPAPLL交聯物)對細胞的毒性作用。方法 將SPAPLL交聯物、CD44抗體和反義寡核苷酸以適宜的質量比混合即可組裝成抗體靶向寡核苷酸複合物；採用噻唑藍比色法測定該靶向複合物或SPAPLL交聯物對培養細胞存活率的影響。結果 該靶向複合物和交聯物在低濃度範圍內（0～62.5 μg/mL）對細胞毒性作用較小，在高濃度（＞125 μg/mL）時對細胞毒性作用顯著增強；游離PLL對細胞的毒性作用較強，但游離SPA無毒性作用。結論 抗體靶向寡核苷酸複合物和SPAPLL交聯物在常用濃度範圍內對轉染細胞無毒性作用。
抗體的輕、重鏈嵌合基因共轉染受體細胞
目前將重組子導入宿主細胞主要採用的方法有磷酸鈣沉澱法、DEAE-葡聚糖街道法介導法、聚季銨鹽介導法、原生質體融合法、電轉染法以及微注射法。其中以電轉染效率較高。
材料和試劑
小鼠骨髓瘤細胞系Sp2/0細胞或P3X63.Ag8.653細胞，或CHO細胞。
已構建的輕、重鏈嵌合基因質粒DNA。
脂質體。
電轉染儀。
無血清培養液、無血清的RPMI 1640、20％胎牛血清的培養液。
霉酚酸，G418，次黃嘌呤，黃嘌呤，胸苷。
羊抗人k鏈，人IgG標準品，酶標羊抗人IgG，酶標板等ELISA檢測所用材料和試劑。
6孔細胞培養板，24孔培養板、48孔培養板以及96孔細胞培養板等細胞培養所用試劑和器皿。
CO2培養箱。
操作步驟
1．脂質體轉染法
於6孔板中接種培養SP2/O細胞，至鋪滿孔底，無血清的RPMI 1640洗三次細胞，並加入適量無血清培養液(約3ml)。
各取20μg輕、重鏈嵌合基因質粒DNA，用無菌水稀釋，與預先稀釋的4μg脂質體混合，總體積為100μl，室溫放置15min，共轉染上述SP2/O細胞；邊搖邊加入DNA-脂質體混合物。
於37℃，5％CO2溫箱培養10h以上，然後每孔加入3ml含20％胎牛血清的培養液q；輕輕吹打細胞，分裝一半到另一空白的孔內，培養24h後，換成選擇培養液(含霉酚酸1μg/ml，G418 1μg/ml，次黃嘌呤6.8μg/ml，黃嘌呤2.0μg/ml，胸苷1.9μg/ml)，2周后，換成次黃嘌呤、黃嘌呤和胸苷的培養液，並逐步降低三者含量直到換成正常的培養液。
一般於轉染5d後便可觀察到由少量細胞組成的集落，待細胞集落長滿2/3孔底時，即可用ELISA檢測上清液的抗體活性。
2．電轉染法
用一50ml離心管收集對數生長期的SP／20細胞，室溫離心1000r/min´10min，棄上清。用30ml置冰預冷的PBS(pH7.3)重懸細胞，取1滴懸液顯微鏡下計數，取1´107細胞。
質粒DNA的酶切消化：為使質粒DNA線性化，以利於電轉染，可使用PvuⅠ分別酶切消化VH、VL重組質粒。因為表達載體上只有PvuⅠ的單一酶切位電。
電轉染：取１ml冰預冷的PBS（pH7.3）+hepes(100mmol/L)重懸細胞(1´107細胞/ml)，取700ml，加入預冷的電轉染樣品杯中；用100ml冰預冷的PBS（pH7.3）+Hepes(100mmol/L) 重懸上述製備的PvuⅠ酶切消化的VH、VL重組質粒，將質粒DNA懸液加入樣品杯中，混勻（以上操作均在冰上進行）。選用Bio-rad公司的Gene Pulser Transfection Apparatur 165-2078或Eppendorf公司的Multiporator電轉染儀進行電穿孔轉染。然後將樣品杯取出，置冰浴10min。
取一支無菌試管，加入12ml含20%FCS的1640培養液，並將電轉染杯中的樣品移入培養液中，混勻，接種24孔培養板（0.5ml/孔）,並以未轉染的SP/20細胞作為對照，培養24h~48h後，換成選擇培養液(含霉酚酸1μg/ml，G418 1μg/ml)。
一般於轉染5d後便可觀察到由少量細胞組成的集落，待細胞集落長滿2/3孔底時，即可用交叉ELISA雙抗夾心法檢測上清液的抗體活性。
3．克隆與檢測
交叉ELISA雙抗夾心法：以羊抗人k鏈抗體包被酶標板，並用封閉液封板，加入待測上清，孵育後加入酶標羊抗人IgG，孵育後加底物顯色，用酶標儀檢測。
採用間接免疫螢光法顯微鏡技術或FCM檢測待測上清與轉鐵蛋白受體陽性細胞的結合率。
用有限稀釋法亞克隆陽性孔細胞。
製備足夠的抗體作進一步檢測和鑑定。
分別用抗人重鏈特異抗體、抗人輕鏈特異抗體、抗小鼠Fab抗體作ELISA和Western blot鑑定表達產物是否為人-鼠嵌合抗體。
表達抗體的進一步純化，抗體親和力、特異性、活性等的測定。
注意事項
由於目前抗體基因庫的資料有限，上述較常用的引物可能不適於擴增一些特殊單抗的基因。此外，對某些雜交瘤細胞株亦可擴增出無抗體功能的VL基因，應重新設計引物。
嵌合抗體保留了鼠源性單抗性單抗的可變區，體內套用時仍有較強的HAMA反應。第二代抗體的人源化是將鼠單抗可變區中FR換成人的FR，保留只與抗原結合的CDR部位，這是真正意義上的人源化抗體。
相關連線
http://journal.shouxi.net/html/qikan/dxxb/gdyxyxb/20066246/jcyyfyx/20080831062524318_319270.html
http://www.uscnlife.cn/web/page/news4659.htm
