概述
愛滋病檢測,是指採用實驗室方法對人體血液、其他體液、組織器官、血液衍生物等進行愛滋病病毒、愛滋病病毒抗體及相關免疫指標檢測
愛滋病主要的檢測方法有以下幾種:
抗體檢測
主要有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和免疫螢光試驗(IFA)。ELISA用去污劑裂解HIV或感染細胞液提取物作抗原,IFA用感染細胞塗片作抗原進行抗體檢測,如果發現陽性標本應重複一次。為防止假陽性,可做Westernblot(WB,蛋白印跡法)進一步確證。
WB法是用聚丙烯醯胺凝膠電泳將HIV蛋白進行分離,再經傳移電泳將不同蛋白條帶轉移於硝酸纖維膜上,加入病人血清孵育後,用抗人球蛋白酶標抗體染色,就能測出針對不同結構蛋白抗體,如抗gp120、gp41、P24抗體,特異性較高。
快速檢測法,也稱為金標法,也是抗體檢測的一種方法,根據免疫層析法的原理,用於HIV抗體檢測的定性檢測。
抗原檢測
用ELISA檢測P24抗原,在HIV感染早期尚未出現抗體時,血中就有該抗原存在。由於P24量太少,陽性率通常較低。現有用解離免疫複合物法或濃縮P24抗原,來提高敏感性。
核酸檢測
用PCR法檢測HIV基因,具有快速、高效、敏感和特異等優點,目前該法已被套用於HIV感染早期診斷及愛滋病的研究中。
病毒分離
常用方法為共培養法,即用正常人外周血液分離單個核細胞,加PHA刺激並培養後,加入病人單個核細胞診斷及愛滋病的研究中。
症狀
愛滋病症狀愛滋病初期舌頭症狀比較典型,愛滋病的臨床症狀多種多樣,愛滋病一般性症狀象傷風、流感、全身疲勞無力、食慾減退、發熱、體重減輕、隨著病情的加重,症狀日見增多,如皮膚、粘膚出現白色念球菌感染,單純皰疹、帶狀皰疹、紫斑、血腫、血皰、滯血斑、皮膚容易損傷,傷後出血不止等;以後漸漸侵犯內臟器官,不斷出現原因不明的持續性發熱,可長達3-4個月;還可出現咳嗽、氣短、持續性腹瀉便血、肝脾腫大、並發惡性腫瘤、呼吸困難等。什麼是愛滋病病毒抗體測試
愛滋病病毒抗體測試尋找愛滋病毒的跡象,你的身體。當你得到的愛滋病毒測試,您通常會給出一個血液樣本,但也有愛滋病毒測試,使用你的嘴尿或液體擦拭,而不是其他類型。有些測試需要數天的結果,但快速HIV測試給了大約20分鐘的結果。
哪裡可以得到愛滋病病毒抗體測試許多地方提供愛滋病毒測試。這裡有一些偉大的方式找到您附近的愛滋病毒檢測的位置:
使用你的螢幕右側的愛滋病毒預防和服務定位器。只要輸入您的郵政編碼,你會得到一張地圖,告訴您附近的考試地點。
聯繫你們州或當地衛生部門。
您也可以讓愛滋病病毒抗體測試的醫護人員。許多醫療診所,物質濫用計畫,社區衛生中心和醫院提供了他們。
大多數愛滋病毒測試,尋找抗體的病毒,而不是愛滋病病毒本身。HIV抗體出現在你的血液,尿液和唾液作為你的免疫系統開始試圖對抗病毒。你的身體,使不同的抗體來對抗愛滋病毒感染者不同的威脅,所以測試看起來專門為愛滋病毒抗體,看看是否感染了你。
我應該測試愛滋病毒是通過傳播的危險行為。如果你回答“是”為下列任何一個問題,你應該得到一個愛滋病病毒抗體測試:
你有沒有注射藥物或類固醇或與他人共享設備(如針頭,注射器,工程)?
你有過無保護的肛門,口腔,陰道性交或未知的病毒與合作夥伴的地位?
你有沒有毒品或金錢換取性?
你被診斷出患有,或接受治療,肝炎,肺結核(TB),或性傳播感染(STI)的?
你有過不安全性行為的人誰可以回答“是”為了在上述任何一個問題?
您是否懷孕或計畫懷孕?
如果你繼續從事高風險行為,CDC建議您獲得了一個愛滋病毒試驗,至少每年一次,並有可能更加頻繁。 跟你對一個測試計畫是適合您的醫護人員。
我為什麼要測試?獲得測試可以給你一些重要信息,並且可以幫助您和他人安全的。例如:
了解自己的愛滋病毒狀況的測試可以給你安心,並且是唯一的方法可以確切地知道。
當你和你的伴侶知道對方的愛滋病毒狀況,你可以了解你的性的行為決策,如何保持安全。
如果您已懷孕或計畫懷孕,知道你的狀況,可以幫助保護您的孩子被感染的。
如果你發現你是愛滋病毒抗體呈陽性,你可以進入早期治療。這增加了保持健康的機會。
如果你知道你是HIV陽性,也可以採取措施來保護您的性別或藥物使用從被感染的合作夥伴。
平均來說,你可能需要等待1-3個月,從曝光時間可能得到準確的測試結果。這是因為,如果你被感染,它可以把你的身體,同時開始做愛滋病毒抗體。此抗體之間的時間當你接觸到愛滋病毒和愛滋病毒的時間,你可以測試呈陽性被稱為視窗期。
如果你發生後可能接觸愛滋病病毒抗體測試前3個月內,你應該考慮讓3個月後再次進行試驗,以確認你的結果。
愛滋病毒測試,超過99%的準確,如果你把一個可能接觸後3個月。(在此之前,測試也不會接你的愛滋病毒抗體的存在。)
什麼是“負”結果意味著什麼?如果您的測試回來的負面,這意味著在測試中沒有發現任何證據表明HIV抗體的身體在你的。但是消極的結果只是意味著找不到愛滋病毒測試。根據暴露時,它仍然是可能的,你可能有愛滋病毒。如果你在測試前3個月後曝光,測試可能會錯過任何體液中的愛滋病毒。這就是為什麼大多數醫療保健機構鼓勵你有一個後續試驗3個月後。
如果您在測試進行後續的危險行為之間的時間,你參加考試並獲得你的結果,或者在你的第一個測試和跟蹤,您的測試結果可能不準確。測試只能告訴你什麼是你的愛滋病毒狀況是,當你把它,所以如果你暴露於愛滋病毒測試後,你走了,結果可能不會顯示您目前的愛滋病毒狀況。
為了得到準確的結果,而你正在等待參加測試,或把自己的結果:
不要注射毒品或者總是使用清潔設備,也不要共用針頭或工程
沒有性別或總是使用保護(安全套或牙醫大壩),如果你做。
如果您的測試回來陽性,這意味著它發現的證據,你的血液愛滋病毒抗體。如果你有一個積極的愛滋病毒測試,測試中心將再給你一次測試,以確保第一次測試的結果是正確的。
有信譽的測試中心總是做這些“驗證”測試,因為有一個非常小的機會,第一個測試是錯誤的。如果第二次測試有相同的結果,你將被診斷為“愛滋病毒抗體陽性者。”
如果發現我身邊有愛滋病毒陽性診斷,我該怎么辦?
如果你對診斷感染愛滋病毒,你應該做以下事情,即使你不覺得噁心:
誰找到一個有經驗的醫護人員治療愛滋病毒。該檢測中心通常可以推薦一個人。
獲得其它性病和結核病篩查。如果你有愛滋病毒,這些感染可能會導致嚴重的健康問題。
保持健康的生活方式。吸菸,飲酒過量,或服用違禁藥物會削弱你的免疫系統,使愛滋病毒增加你的身體。
採取安全性行為。安全套是預防愛滋病毒傳播非常正確和一貫使用時有效。
告訴你的夥伴或對您的愛滋病毒狀況的合作夥伴之前,你有任何與他們的性接觸(肛門,口腔或陰道)的類型,不與任何人共享針頭或注射器。
診斷為愛滋病毒和愛滋病毒保持健康與資源節的更多信息和。
被診斷患有愛滋病毒並不意味著你有愛滋病。獲得性免疫缺陷綜合症(愛滋病)是愛滋病毒病的最後階段。只有在你得愛滋病,愛滋病毒已嚴重損壞你的免疫系統。這就是為什麼它是如此的重要,儘快獲得治療愛滋病,你測試呈陽性愛滋病毒的早期治療可以控制愛滋病毒在不斷發展並防止它從。有關詳細信息,請參閱疾病預防控制中心的愛滋病病毒基本信息。
將其他人知道我的愛滋病毒檢測結果和狀態?
您的測試結果都受州和聯邦隱私法。
無論任何人都可以知道您的測試結果或愛滋病毒感染狀況取決於什麼樣的,你需要測試。有兩類型的愛滋病病毒檢測試驗保密和匿名檢測。
大多數愛滋病毒測試是保密的測試。如果你需要保密的愛滋病病毒抗體測試,您的姓名和其他身份信息將被連線到您的測試結果。結果將在您的醫療記錄,可能是公司分享您的醫療保健提供商和您的保險。否則,沒有人可以訪問你的愛滋病毒測試結果,除非你告訴他們。
有些地方還提供匿名愛滋病病毒抗體測試。如果你拿到一個匿名的愛滋病毒測試,沒有任何連線你的測試結果給你。當你參加考試,你會得到一個特別號碼或代碼,使您得到您的結果。
如果您測試愛滋病毒呈陽性,測試網站將結果報告給你的國家衛生部門和疾病預防控制中心。所有個人身份信息將被清除掉。公共衛生官員不與其他人共享此信息,包括保險公司。
許多國家已經從匿名測試了,因為保密測試可以幫助公共衛生官員保持跟蹤做了更好的工作,有多少人感染愛滋病毒並在全國各地的愛滋病毒的比率最高。這使他們能夠獲得的資源的領域,最需要他們。
有關詳細信息,請參閱疾病預防控制中心的有關隱私問題的成本,保險和。
合作夥伴
如果您測試呈HIV陽性,你的性或藥物使用也可能被感染的合作夥伴。重要的是,他們知道他們已經暴露,讓他們也可以進行測試。
你可以告訴他們自己,但是如果你對這樣做,你可以問你的醫生或當地衛生部門告訴你他們的緊張。衛生部門不會透露你的名字你的合作夥伴。他們只會告訴你,他們曾暴露於愛滋病毒測試,並應得到的合作夥伴。
大多數國家的法律要求你,告訴你的性夥伴,如果你是HIV陽性,然後和你做愛(肛門,口腔或陰道)。您可以充電不能成為犯罪的感染,在許多地方,如果你不告訴,即使你的伴侶。
家人/朋友
在大多數情況下,你的家人和朋友將不知道你的測試結果或愛滋病毒感染狀況,除非你告訴他們自己。
如果您在18歲以下,有可能是這樣的例外。所有50個州和哥倫比亞特區將讓你得到檢驗和)治療性傳播感染(性病,但是一些州允許您的醫護人員告訴你的父母(),如果他們認為這樣做感興趣的是你最好的。有關詳細信息,請參閱Guttmacher研究所的國家政策的摘要:未成年人獲得性病服務。
僱主
在大多數情況下,你不知道你的僱主將愛滋病毒狀況,除非你告訴。但是,你的僱主是否有權利要求,如果您有任何健康狀況會影響你做你的工作能力,或構成嚴重威脅別人。(一個例子可能是醫護人員像一個外科醫生,誰做的程式那裡有一個血液或其他體液交換的風險。)
如果你有你的僱主通過醫療保險,保險公司不能合法地告訴你的老闆,你有愛滋病毒。但是,它可能是你的僱主能找到,如果保險公司提供的詳細信息您的保險僱主支付的好處是成本或。
愛滋病毒感染所有的人都包括在美國殘疾人法案(ADA)。這意味著,你的僱主你不能因為你的歧視愛滋病毒的工作狀態,只要你能做到你的。
內容
包括監測、檢驗檢疫、自願諮詢檢測、臨床診斷、血液及血液製品篩查工作中的愛滋病檢測。
技術方法
獲得性免疫缺陷綜合徵HIV實驗室技術和方法愛滋病(AIDS)又稱獲得性免疫缺陷綜合徵,是由人類免疫缺陷病毒(HⅣ)感染所引起的一種免疫缺陷性疾病。HⅣ感染的診斷是愛滋病預防控制工作的重要組成部分,建立敏感實用的檢測方法對於監測、診斷或血液篩查,控制愛滋病的流行顯得尤為重要。以下本文就HⅣ的檢測技術現狀及進展做一綜述。
感染機制
HⅣ病毒侵入人體後,其表面糖蛋白gp120與細胞表面受體蛋白CD4以高親和力結合,吸附到宿主細胞上;gp120再與宿主細胞表面輔助受體相互作用,使病毒與宿主細胞膜更接近;gp41產生一系列構象變化,其N端的融合肽片段插入宿主細胞膜,導致病毒包膜與細胞膜的最終融合,病毒RNA進入細胞。在HⅣ感染後,最先能夠監測到病毒RNA、然後是p24抗原,最後是抗體。
感染標誌
在感染後的10~14d內,病毒RNA水平是呈指數上升,隨後下降並保持在持續穩定的水平上,進入HⅣ無症狀期。p24抗原水平隨著病毒RNA水平的發展而發展,在急性感染期就可以出現,被認為是病毒複製的間接標誌,但由於檢測方法的靈敏度不夠而使得其檢出時間要比RNA晚。從HⅣ感染到能夠檢測出HⅣ抗體這一時期,被稱作“視窗期”。在視窗期,能夠通過病毒RNA、p24抗原和CD4淋巴細胞水平來確定HⅣ感染。CD4淋巴細胞水平隨著感染的發展而逐漸下降,當其在血液中細胞下降到200個/mL時,就會發生嚴重的免疫缺陷,患者就被確診為愛滋病。病毒RNA、p24抗原、HⅣ抗體和CD4淋巴細胞水平可以用來確定HⅣ感染、檢測病情發展。
病毒分類
HⅣ在病毒分類中屬逆轉錄病毒科慢病毒屬中的人類免疫缺陷病毒組。迄今為止,根據血清學反應和病毒核酸序列測定,全球流行的HⅣ可分為2型:HⅣ?1型和HⅣ?2型。在HⅣ?1型內,根據編碼包膜蛋白的env基因和編碼殼蛋白的gag基因序列的同源性又進一步分為3個組:M組(主要組)、O組(外圍組)和N組(新組或非M非O組),M組內又可分為A?J10個亞型。在HⅣ?1型和HⅣ?2型之間,其核苷酸序列有45%的同源性,並且存在免疫交叉反應。套用免疫印跡法(Westblot)可以將二者明確地區別開來。
檢測方法
目前檢測HⅣ的方法有100多種,總體來說可以分為抗體檢測和病毒檢測兩大類。病毒檢測包括細胞培養(病毒分離)、p24抗原檢測和病毒核酸檢測。早期對HⅣ的診斷主要是通過血清學試驗檢測抗HⅣ的抗體,間接地診斷HⅣ感染。近幾年,分子生物學方法不斷被套用到HⅣ的檢測中,HⅣ的實驗室診斷方法取得了很大的進展,核酸檢測已經成為了HⅣ實驗室診斷的發展方向。
抗體通常是在感染後3~8周能夠被檢測出來。目前,大多套用雙抗原夾心法,這種方法具有很好的靈敏性和特異性。抗體檢測由初篩和確認試驗組成,初篩試驗呈陽性的必須進行確認試驗。酶聯免疫吸附分析(ELISA)方法有一定的靈敏度,且操作簡單、快速,適合對大量樣品的檢測。因此,是目前臨床通用的初篩檢測方法。國際上有3種確認試驗方法,包括免疫印跡試驗、條帶免疫試驗及免疫螢光試驗,目前以免疫印跡試驗最為常用。
在視窗期,病毒抗體不能被檢出,但可以檢測到病毒相關抗原或分離病毒。抗原能夠在個體感染後先於血清轉化2~18d被檢測到。因此,在血清轉化期通過檢測p24抗原有著很大的優勢,可以作為早期輔助診斷HⅣ感染的一種方法。
病毒培養
病毒培養是檢測HⅣ感染最精確的方法。一般採取培養外周血單個核細胞(PBMC)的方法進行HⅣ的診斷。
病毒核酸檢測通常是通過檢測HⅣRNA水平來反映病毒載量,具有很高的靈敏度,使用適時螢光聚合酶鏈反應(PCR)技術,能夠在HⅣ感染的前2周檢測到病毒核酸。病毒核酸檢測方法可用於HⅣ的早期診斷,如視窗期輔助診斷、病程監控、指導治療方案及療效測定、預測疾病進程等。目前常用的測定方法有逆轉錄PCR實驗(RT PCR)、核酸序列擴增實驗(NASBA)、分支DNA雜交實驗(bDNA)等。使用高靈敏度的適時螢光PCR技術,能夠在HⅣ感染的前2周檢測到病毒核酸。
抗體抗原檢測
HⅣ抗體一般在人感染後幾周逐漸出現,可延續至終生,血清學試驗分為初篩和確認試驗。最常用的初篩試驗和確認試驗分別是酶聯免疫吸附試驗和免疫印跡試驗(WB)。常規實驗方法:酶聯免疫吸附試驗、免疫印跡試驗(WestBlot)、間接免疫螢光法(IFA)。快速檢測方法:明膠顆粒凝集試驗、斑點免疫結合試驗、P24抗原的檢測、分子生物學方法、RT?PCR檢測法、螢光實時PCR檢測技術、支鏈DNA(bDNA)、連線酶酶促鏈式反應(LCR)、核酸序列依賴性擴增(NASBA)、轉錄介導的擴增(TMA)酶聯免疫吸附試驗
ELISA法的基本原理是免疫反應物通過化學或免疫學的方法形成酶結合物,酶結合物能與待檢樣品中相應的抗原或抗體結合成為免疫複合物,然後加入酶底物,經酶的催化或水解作用,無色底物產生顏色,用肉眼、分光光度計觀察結果。初篩用的HⅣELISA試劑目前已經發展到第四代檢測試劑。第一代試劑主要以病毒裂解物或部分純化的病毒抗原包被反應板,以檢測血清中的抗體。由於包被的抗原不很純,假陽性率較高。第二代試劑使用基因工程方法得到的重組抗原和合成肽包被反應板,由於純化抗原的使用,特異性有了很大提高。第三代試劑使用雙抗原夾心法檢測抗體,進一步提高了敏感性。第四代試劑則在第三代的基礎上進一步增加了P24抗原的檢測,把HⅣ抗原和抗P24的抗體同時包被反應板,可同時檢測血清中的HⅣ抗體和P24抗原。
免疫印跡試驗
免疫印跡試驗主要用於確認試驗,基本原理是HⅣ全病毒抗原經過SDS?PAGE電泳,將分子量大小不等的蛋白帶分離開來,然後再把這些已經分離的不同蛋白帶電轉移到硝酸纖維素膜上。將此膜切割成條狀,每一條硝酸纖維素膜上均含有經電泳分離過的HⅣ病毒抗原。將待檢血清樣品用稀釋液稀釋成1/100,再把它直接加到硝酸纖維素膜上,恆溫震盪,使其充分接觸反應,血清中若含有抗HⅣ抗體,就會與膜條上的抗原帶相結合。加入抗人IgG酶結合物和底物後,即可使有反應的抗原?抗體結合帶呈現紫褐色,根據出現條帶情況判定結果。有報告說,免疫印跡試驗的特異性不是很好,有大約2%的假陽性率,但免疫印跡試驗依然是目前最常用的HⅣ確認試驗。
免疫螢光試驗(IFA)
基本原理為套用H?9或HUT?78培養細胞作為載體,用HⅣ感染細胞,該細胞內就會含有HⅣ抗原,將HⅣ感染的淋巴細胞塗於玻片上,固定,製備為抗原片,加入待檢血清,待檢血清中的抗HⅣ抗體與抗原結合後,再與螢光素標記的抗人Ig結合,在螢光顯微鏡下可見到細胞內有黃綠色螢光。
明膠顆粒凝集試驗(PA)
PA的基本過程是先將樣品稀釋,然後分別加入經抗原致敏的和未致敏的明膠顆粒,混勻後保溫(一般為室溫)。當血清中有HⅣ抗體存在時,經抗原致敏的明膠顆粒與抗體發生抗原抗體反應,根據明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結果。PA操作簡便,無需特殊儀器設備,適合對少量標本的檢測。
斑點印跡試驗(或免疫層析/或滲濾)
斑點印跡試驗一般採用硝酸纖維素膜作固相載體,用HⅣ抗原包被於固相載體,加入待測標本(可為血清、血漿、尿液和其他體液),一定溫度反應後洗去未結合於固相載體上的標本,包被抗原和被檢血清中抗體結合,用膠體金(或膠體硒)代替底物連線在葡萄球菌蛋白A上,金標記蛋白A具有與人Ig結合的能力,因而可與被捕獲的HⅣ抗體結合。若樣品中有HⅣ抗體,則薄膜上就會產生一桔紅色斑點(或線條),一般3~10min出結果,特異性較好,較為適宜於偏遠地區臨床用血檢測,但不適於城市地區的獻血員篩查。
生物學方法
隨著生物技術的發展,核酸檢測得到了人們越來越多的重視,它可直接檢查HⅣRNA,可在發現血清學變化之前檢測HⅣ感染,而且比P24抗原檢測方法更靈敏。
多聚酶鏈反應檢測法
PCR技術的基本原理類似於DNA的天然複製過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成。
①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備。
②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。
③引物的延伸:DNA模板—引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按鹼基配對與半保留複製原理,合成1條新的與模板DNA鏈互補的半保留複製鏈,重複循環變性—退火—延伸三過程,就可獲得更多的“半保留複製鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成1個循環需2~4min,2~3h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。檢測HⅣ?RNA,需要先利用逆轉錄反應將RNA轉錄為cDNA,繼而以cDNA為模板進行PCR擴增即可,這樣的反應稱為RT-PCR。
實時螢光定量PCR技術
實時螢光定量PCR技術,是指在PCR反應體系中加入螢光基團,利用螢光信號實時監測整個PCR進程,最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
本技術的原理是使用螢光基團標記探針,5′端標記螢光基團R,3′端標記淬滅基團Q,在沒有PCR擴增時,由於螢光基團和淬滅基團空間距離很近,使螢光基團被淬滅,不發螢光;而當PCR擴增時,引物與螢光標記的特異性探針同時結合在模板上,螢光標記的探針與模板的結合位置位於上下游引物之間,利用Taq酶的5′?3′外切酶活性,將螢光探針水解,螢光基團被釋放出來,由於在空間上與淬滅基團分開,則發出螢光。發出的螢光可以被螢光探頭檢測到,一邊擴增,一邊檢測,這樣就實現了“實時”檢測。該技術不僅實現了PCR從半定量到定量的飛躍,而且與常規PCR相比,它具有特異性強、自動化程度高、有效解決了PCR污染問題等特點。
支鏈DNA檢測法——bDNA
bDNA是定量檢測血漿中的HⅣ?1型RNA的一種方法。bDNA是指人工合成的帶有側鏈的DNA片段,在其每個側鏈上都可以標記被激發的標記物。將HⅣ的RNA通過離心從病毒顆粒中釋放出來,然後用捕獲探針1將其捕獲到微孔中。捕獲探針2與病毒RNA的另一部分特異結合,又與預放大探針結合。後者再與放大探針即bDNA探針雜交。兩套靶探針分別與病毒RNA的pol基因的不同區域特異結合。在微孔中形成了HⅣRNA?寡核苷酸複合物。再加入1種化學發光底物孵育後可放大化學發光信號。通過發光強度來定量,因為發光強度與樣品中HⅣRNA含量成比例。bDNA不存在擴增物的交叉污染,這較PCR是一大進步。bDNA有數十個覆蓋整個基因組的探針,可以方便地檢測HⅣ某些變異株,但靈敏度不及PCR,提高bDNA靈敏度是一大難點。
核酸序列依賴性擴增法(nucleicacidsequencebasedamplification,NASBA)
NASBA是由一對引物介導的、連續均一的、體外特異性核苷酸序列等溫擴增RNA的新技術。反應在42℃進行,可在2h內將RNA模板擴增約109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆轉錄酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物進行擴增。整個反應分非循環相和循環相:在非循環相中,引物I與模板RNA退火後在AMV逆轉錄酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA雜合體,隨即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ與cDNA退火,在反轉錄酶作用下合成第2條DNA互補鏈。雙鏈DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,經其啟動子序列起動而轉錄RNA,RNA又可在反轉錄酶的作用下反轉錄成DNA,進入循環相,對模板進行大量擴增。
轉錄介導的擴增技術(transcriptionmediatedamplification,TMA)
TMA技術原理與NASBA基本一致,略有不同之處是TMA利用的是MMLV逆轉錄酶及T7RNA聚合酶兩種酶,MMLV逆轉錄酶既有逆轉錄酶的活性又具有RNA酶H活性。反應在41.5℃進行,可在1h內將RNA模板擴增約109倍。
連線酶酶促鏈式反應(LCR)
LCR是基於靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連線的一種探針擴增技術,是繼PCR後新發展的一種較有前景的體外擴增技術。它的原理就是由2段寡核苷酸單鏈DNA探針與目標序列雜交,當該2段DNA探針與沒有發生突變的模板褪火後,如果2探針是緊鄰的,中間沒有核苷酸間隔,則可在連線酶作用下連線起來,連線以後的新鏈又可以作為模板,引導下一周期的連線產生新的子鏈。若連線區段發生核苷酸的鹼基突變,則連線反應不能發生,擴增反應終止。
技術不足
細胞培養的方法檢測HⅣ專一性強,不會出現假陽性,對於確認那些抗原/抗體檢測不確定的個體和陽性母親新生兒是否感染HⅣ有著重要的意義。但是須要有一定數量的感染細胞存在才能培養和分離出病毒來,因而敏感性差、操作時間長、操作複雜,必須在特定的P3實驗室中才能進行,且費用較高(每次培養需要約200~500美元),不適用於臨床。
p24抗原檢測能夠在病毒開始複製後檢測到血液中的可溶性p24抗原,但易出現假陽性。因此,陽性結果必須經中和試驗確認,該結果才可作為HⅣ感染的輔助診斷依據。HⅣ?1p24抗原檢測陰性,只表示在本試驗中無反應,不能排除HⅣ感染。
病毒核酸檢測方法具有很高的靈敏度,對疾病進展的監測、抗病毒療效觀察和耐藥性監測非常重要。但是,由於HⅣ基因的多樣性,沒有一套引物可以覆蓋所有的HⅣ序列,使檢測的敏感性又受到限制;此外現有的病毒核酸檢測方法或是檢測儀器、檢測試劑昂貴,或是操作複雜,對操作人員要求高,既難以在一般實驗室推廣,又不適用於對大量患者的快速檢測,同樣不適合廣泛的臨床套用。
因此,既要提高檢測的敏感性、特異性,縮短視窗期,又要簡便、快速和降低成本已成為HⅣ檢測技術發展的要求和方向,很多的研究正致力於尋找病毒檢測的替代技術。
技術進展
近年來,HⅣ檢測技術取得了很大進展。如發展了ICDp24抗原測定法(immune?complexdisassociate,免疫複合物解離,ICD)、第四代HⅣ檢測試劑、超敏感EIA、線性免疫酶測定(linealimmunoenzymaticassay)等,使檢測出HⅣ感染的時間大大提前。
試劑發展
從1985年第1代HⅣ抗體檢測試劑問世到現在,HⅣ血清學檢測試劑已經發展到了第4代。第4代ELISA試劑的優點在於能同時檢測抗原和抗體,降低血源篩查的殘餘危險度。與第3代抗HⅣ?1/2試劑相比,檢出時間提前了4~5d,視窗期縮短了1周多,在對愛滋病早期診斷的效果上明顯優於第3代。
但使用第4代試劑對愛滋病毒進行檢測,仍然有2~3周的視窗。此外,由於把抗原和抗體同時包被在反應板上,存在著相互干擾的可能,影響了免疫反應的特異性。而且由於第二視窗期的存在,也使得檢測的敏感性受到影響。一般來講,使用第4代試劑檢測p24抗原,其靈敏度(20~100pg/mL)遠遠低於單獨檢測抗原抗體分析法(3.5~10pg/mL)。從方法學上來講,這種基於ELISA的分析方法,靈敏度終歸是有限的。相對化學發光和時間分辨螢光免疫分析技術等更先進的分析方法,它的靈敏度比較低。由此可見,提高敏感性、特異性、縮短視窗期和簡便快速是HⅣ檢測試劑未來發展的主要趨勢。
檢測方法發展
核酸檢測方法研究進展隨著分子生物學技術的發展,核酸檢測越來越受到人們的重視並將其與抗原抗體反應的高特異性結合起來形成了免疫PCR技術。這一技術具有特異性強和靈敏度高的特點,可用於單個抗原的檢測。這促進了套用PCR技術進行HⅣ核酸檢測的快速發展。自2001年起,COBASAmpliscreenHⅣ1Test等4種HⅣ核酸檢測技術通過了FDA的批准,作為進篩選分析技術來進行HⅣ?1的檢測。最近,實時螢光PCR檢測技術的套用使HⅣ核酸檢測技術又進入到一個新境界。通過這種技術,不但可以進行定性檢測,更重要的是可以進行定量檢測。Barletta等將這一技術套用到HⅣ的檢測中,大大降低了病毒載量的檢測限(0.66個拷貝相當於0.33個病毒粒子)。2002年4月國家藥品監督管理局(SDA)批准了第一個HⅣ螢光PCR檢測試劑盒,2012年我國政府在加大HIV核酸檢測的推廣力度。
p24抗原檢測方法研究進展隨著檢測靈敏度不斷提高,p24抗原的檢測逐漸從主要用於在視窗期輔助早期診斷和進一步縮短視窗期,發展到用於病毒載量測定。目前,p24抗原在以下幾方面都有重要套用:HⅣ?1抗體不確定或視窗期的輔助診斷;HⅣ?1抗體陽性母親所生嬰兒早期的輔助鑑別診斷;第4代HⅣ?1抗原/抗體ELISA試劑檢測呈陽性反應,但HⅣ?1抗體確認陰性者的輔助診斷;監測病程進展和抗病毒治療效果。但現有監測病程進展和抗病毒治療效果均採用昂貴、操作複雜的病毒RNA測定方法。中國HⅣ/AIDS患者絕大部分是在基層,檢測1次病毒載量需要上千元(約1500元),很難在基層普及,對疾病的治療和控制很不利。高靈敏度p24抗原檢測方法的建立成為在開發中國家使用的病毒載量測定方法的一種選擇。
近幾年,國外對建立高靈敏度檢測p24抗原的研究一直沒有停止,如為了提高檢測血清中p24抗原的敏感性,將血清中免疫複合物解離後再進行測定,發展了ICDp24抗原測定法。2003年Sutthent等將免疫複合物熱解離後通過TSA信號放大系統使用ELISA進行檢測,使p24抗原檢測的最小檢出值由原來的10pg/mL降低到0.5pg/mL,在HⅣ?1抗體陽性母親所生嬰兒早期的診斷中與RNA檢測相當,與HⅣ核酸檢測具有可比性,具有重要的實用價值。2004年,來自HⅣ病毒的發現者之一美國馬里蘭大學Dr.RobertC.Gallo所領導的實驗室的一篇高靈敏度檢測p24抗原的研究論文引起了廣泛的關注,p24抗原的檢測成為比病毒核酸檢測更靈敏的方法。2005年來自美國馬里蘭大學的一篇長篇綜述也開始關注p24抗原的檢測,認為這可以作為低成本、適合在開發中國家使用的替代現有昂貴的RNA測定方法的一種選擇。
目前,商品化的p24抗原的標準檢測方法主要是依據夾心ELISA原理。該方法是用抗p24抗原的抗體包被固相的雙抗體夾心法,是檢測抗原最為常用的方法,國內尚未見商品化的HⅣp24抗原檢測試劑的生產。綜上所述,用高靈敏的分析方法診斷愛滋病將有助於實現早期診斷,避免漏檢,有助於對治療愛滋病藥物的療效評價、預測和監測疾病進程,提高檢測的靈敏性、縮短視窗期,是HⅣ診斷方法和診斷試劑持續發展的主要方向。
以上簡述了HⅣ的流行概況和實驗室的檢測技術,相信隨著HⅣ實驗室檢測技術的不斷的改進,尤其是核酸檢測技術的不斷套用,HⅣ檢測的視窗期將會逐步縮短,經輸血傳播HⅣ可能性也將會大大減小。
快速檢測
自1985年第一個愛滋病檢測試劑問世以來,愛滋病檢測已經變得越來越簡便、靈敏、快速、無需特殊設備,可用肉眼直接觀察結果。愛滋病檢測紙條是在ELISA法基礎上發展起來的一種檢測技術,由於其具有操作簡便、快捷、可單份檢測、便於保存、不需特殊設備等優點,也廣泛套用於臨床對HBsAg進行初篩,對急診及無償獻血的現場的篩查有其實用價值,可避免無效採血所造成的浪費,節省了大量的人力、物力,所以更多適用於急診及無償獻血現場篩查等情況的需求。
膠體金法(金標)人類免疫缺陷病毒(HⅣ1/2)抗體檢測試劑盒是套用膠體金免疫層析技術建立的靈敏、特異、操作簡便的一步法HⅣ1/2抗體定性檢測試劑。用於定性檢測人血清或血漿樣本中的HⅣ1型和HⅣ2型的特異性抗體,以輔助診斷HⅣ感染,其陽性結果需用免疫印跡法確認。
其檢測原理是用HⅣ重組抗原和羊抗鼠IgG分別固定於硝酸纖維素膜,並和包被有膠體金標記的HⅣ重組抗原及鼠IgG的玻璃纖維紙片及其他試劑組成。套用膠體金免疫層析技術,採用雙抗原夾心的原理檢測人類血清及血漿樣本中的HⅣ1/2抗體。
檢測過程中,血液標本加到試劑盒的加樣孔中,樣品首先和玻璃纖維紙片上膠體金標記的HⅣ重組抗原混合,接著再往硝酸纖維膜條上層析。如果樣本中含有HⅣ1/2抗體,這些抗體首先與包被HⅣ重組抗原的膠體金結合,這樣混合物往硝酸纖維膜上層析時,便會被固定有HⅣ重組抗原的檢測線(T線)捕獲而形成膠體金標記抗原-抗體-抗原的雙抗原夾心免疫複合物,因而在T線出現一條紅色線條,為陽性結果。如果被檢者血液中沒有HⅣ1/2抗體存在,則不會在檢測線(T線)上形成紅色線條,為陰性結果。在試劑盒上的質控線(C線)包被有羊抗鼠IgG,無論任何情況下都將與鼠IgG-膠體金結合在質控線上出現紅色線條,以證明試劑盒工作正常。
其特點是方便、快速(10分鐘出結果)、準確、是篩查愛滋病患者的首選方法。
快速檢測產品
分兩種一種是血檢試紙一種是唾液試紙
血檢試紙一般有雅培,艾康等
唾液檢測試紙只有一種美國艾威爾的的唾液檢測試紙生產基地是在北京瑪諾生物科技有限公司正規愛滋病檢測試紙生產批號均可以國家食品藥物監督管理局查詢目前也沒有出現過愛滋病試紙的假貨之類的情況出現。
檢測空窗期引
空窗期:從被HⅣ感染之後到可以檢測出病毒所需之時間。使用抗體檢測之方式平均之空窗期為22天。使用抗原檢測方法則可縮減空窗期至16天,而使用核酸檢測法(NAT)則可使空窗期減至12天。
而一個醫學檢測的效果通常使用以下術語描述:
靈敏度:如感染HⅣ時,檢驗結果為陽性的百分比(真陽性/陽性)
特異度:如未感染HⅣ時,檢驗結果為陰性的百分比(真陰性/陰性)
所有的診斷檢查都有局限性,有時候,它們可能會產生錯誤或有疑問的結果。
假陽性:當一個人沒有感染HⅣ時,但檢驗結果卻顯示為陽性。
假陰性:當一個人感染HⅣ時,但檢驗結果卻顯示為陰性。
非特異性反應、高伽瑪球蛋白血症或存在針對其他病原體而類似HⅣ病毒抗原的抗體可能產生假陽性結果。自體免疫性疾病,如系統性紅斑狼瘡,也可能造成假陽性的結果。
檢測時間
愛滋病檢測的最佳檢測時間,對於愛滋病患者來說是一個非常重要的事項,因為患有愛滋病的人,在早期極少出現讓人們感到異常的症狀,所以常常被人們所忽略。一直到了發現症狀的時候,愛滋病就已經到了晚期了,治療已經極為不容易了。所以在感染早期,及時的進行愛滋病檢測,是一項很重要的事項,他能幫助患者及早的發現愛滋病的症狀高危後,一般需要2-4周時間就可以檢測出愛滋病HⅣ抗體。高危行為後,一般需2周時間即可檢測出愛滋病抗體。
愛滋病潛伏期
自1981美國報導首例愛滋病患者以來,愛滋病在全球範圍內廣泛傳播,嚴重威脅著人類的健康。儘管全世界對愛滋病的防治方法進行了大量的研究,但至今仍未獲得有效的預防藥物和治方法,因此對感染者從感染到愛滋病發病這一段潛伏期時間長度的研究對於了解愛滋病的然史、評價治療效果、進行流行預測等方面都有著重要的意義。30年以來,針對監測系統的不同監測數據,對愛滋病潛伏期進行了大量的研究,提出了多種不同的方法,不同方法對愛滋病潛伏期得出了不同的數據,所得到的愛滋病潛伏期結果普遍都在8-9年。至今為止,除了極少數未被確認的個體報告之外,還沒有任何可證實的資料證明有短於1年或者長達20年的愛滋病潛伏期存在。
臨床分期
急性期
大部分病人在愛滋病感染初期,沒有任何症狀。但有一部分病人在感染數天至3個月後,有如流行性流感冒樣或傳染性單核細胞增多症樣症狀:發熱、賽戰、關節疼、肌肉痛、嘔吐、腹瀉、喉痛等,一般在愛滋病毒感染後2至8周出皮疹,血中出現愛滋病毒抗體。最長約半年後出現抗體。
無症狀感染期
在急性期後,沒有臨床症狀,為無症狀的健康人,但體內有愛滋病毒,又稱為愛滋病潛伏期。此後,8年內將有50%的人發展為愛滋病。有報告稱,1至7年內從感染病毒到發病,其比例依次為1.5%,5%,10%,15%,25%,30%和40%。兒童愛滋病潛伏期短,平均為12個月。這時用很敏感的方法檢測愛滋病感染者漿中的病毒核醒量,可預測5年內發病的機率。
艾
滋病前期
無症狀感染期之後,出現明顯的與愛滋病有關的症狀和體徵,有人稱之為愛滋病相關綜合徵,也有人稱之為持續性全身性淋巴腺病等。主要表現在:持續性的淋巴腺腫大,開始於頸部,其次為腋、腹股溝淋巴結等。一般少有兩處以上淋巴結腫大者。體重減輕10%以上。周期性發熱(38攝氏度左右),常持續數月。夜間盜汗。發生單純皰疹病毒、白色念珠菌(屬真菌類)等各種感染。
愛滋病期
由於免疫系統被嚴重破壞,各種致命性機會感染、腫瘤等極易發生。病變可表面在肺、口腔、消化系統、神經系統、內分泌系統、心臟、腎臟、眼、關節、皮膚等等。已發生機會性感染者,平均存活期為9個月。
檢測實名制
衛生部2012年2月8日召開例行新聞發布會,多省擬推行愛滋病檢測實名制,針對部分省份擬推行愛滋病檢測實名制,實名制利於治療和預防。自《全國愛滋病檢測技術規範》2009版頒布之日,愛滋病確證檢測必須提供身份證,整個檢測過程,檢驗人員有義務對被檢測人員的信息保密。