自殺質粒

自殺質粒概述

自殺質粒（suicide plasmid）：通常為R質粒的衍生質粒，常有宿主範圍廣的特點，具有接合轉移基因。

它的複製需要一種特殊的蛋白，大多數細菌不產生這種蛋白質，因此，當進入寄主細胞時，要么不能複製，被消除，要么被整合入染色體上，和染色體一起複製。利用自殺質粒的這個特點，將基因工程技術構建的基因缺失的DNA片斷，克隆入自殺質粒，利用缺失基因兩端的同源片斷，定位自殺質粒的整合位點。利用同源性DNA片斷可發生重組的原理，構建精確基因缺失菌株。在多數情況下，利用自殺質粒，可隨心所欲缺失大多數基因的任何部分。

建基因缺失工程菌的條件

用自殺質粒系統構建基因缺失工程菌，關鍵在於選擇適當的自殺質粒，自殺質粒應具備以下條件：①自殺質粒在受體菌中不能複製；②自殺質粒必須帶有一個在整合到染色體內以後可供選擇的抗性標記；③自殺質粒帶有易於克隆的多克隆位點。

自殺性質粒載體的構建

自殺性質粒載體完全可以自己構建，只要保證兩點：１，自殺性質粒載體不能在你的宿主菌里進行複製，也就是說載體上不能有能在宿主菌中複製的複製子；２，要由篩選標記． 自殺性質粒載體不能在你的宿主菌里進行複製，否則會導致細菌染色體突變株的構建失敗。但是在構建時，要注意以下方面： 1。在製備質粒載體和DNA插入片斷時：2ug 5kb大小的線狀DNA大約含有1.4poml/L5'末端磷酸。5‘突出端脫磷需要CIP0.01u/pmolDNA末端，平端或凹陷脫磷需CIP0.5u/pmolDNA末端。 2。連線質粒載體和DNA插入片斷時：（1）初次實驗的可以建立幾種不同的連線體系，比如插入片段與載體分子數比率可以為3：1，1：1，或1：3。（2）可以嘗試三種溫度和時間的連線如4度，過夜；15度，4－6小時；25度，1小時。 3。細菌轉化和篩選時：（1）如果是感受態細胞，－80度儲存的在5－6周后,轉化率低。可用一已知標準閉環質粒鑑定感受態細胞的轉化能力。（2）用無DNA轉化物的感受態細菌鋪板，如果有菌落生長，說明其中抗生素濃度不夠。