肝癌基因治療學
主編：王廣義
副主編：史小偉 趙俊傑
封面設計：徐江偉
出版單位：世界圖書出版社
封裝：精裝
頁數：473頁
內容簡介
基因治療的方式有兩類，一類為基因矯正和置換；另一類為基因增補，不去除異常基因，而是通過外源基因的非定點整合，從而補償缺陷基因的功能，達到治療目的。本文就原發性肝癌的基因治療進展綜述如下。
具體療法
1.反義基因治療肝癌的發生、發展過程中許多癌基因及生長因子的基因產物大量表達，套用反義核酸在轉錄水平和翻譯水平阻斷某些基因的異常表達，以期阻斷癌細胞內的異常信號傳導，使癌細胞進入正常分化軌道或引起細胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長。反義基因包括反義RNA、反義DNA和核酶3類。根據鹼基互補的原理，利用與目標基因特定序列互補的短鏈核苷酸片段來封閉目標基因表達，或利用核酶與相應的mRNA結合使其降解，均可達到基因治療的目的。Wang等[1]利用AFP反義寡核苷酸治療體外和裸鼠的SMMC?7721肝癌模型取得了明顯的抗癌作用，減少了AFP的表達，抑制SMMC?7721細胞的增生。有研究顯示[2]，引用反義胰島素養生長因子(Insulingrowth factor I，IGF?I) 寡核苷酸轉染人肝癌細胞，發現肝癌細胞的凋亡陽性指數明顯增加，並且被轉染的癌細胞的CEA和AFP的分泌下降，表明反義IGF?I寡核苷酸可以抑制肝癌細胞的增殖、促進分化並誘導腫瘤細胞的凋亡。
2.自殺基因治療某些病毒、細菌等原核生物含有一類基因，其編碼的酶能將原來無毒的藥物前體轉化為具有細胞毒性的代謝物而殺傷宿主細胞，這類基因稱為“自殺基因”。這種特有的轉換酶基因-自殺基因導入體內後，利用其產生的酶將無毒或低毒的藥物前體轉成細胞毒性代謝產物，從而殺死腫瘤細胞。近年來有關此類研究顯示出良好的套用前景。目前常用針對肝癌基因治療的有單純病毒Ⅰ型胸苷嘧啶激酶/戊環鳥苷系(HSV?TK/GCV) 和胞嘧啶脫氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5Fc)等系統。有研究表明[3]，將“自殺基因”單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(herpes Simplex Virus Thymidine Kinease，HSV?TK)轉染腫瘤組織，則該細胞的HSV?TK將前體藥Gancyclovir(GCV)轉化為對分裂細胞有殺傷作用的代謝產物，特異性殺傷腫瘤細胞，對肝細胞肝癌在體外有一定的療效。Won等[4]通過單純皰疹病毒將AFP反轉剪接靶RNA構成酶導入肝癌細胞，取代HCC高效表達AFP的RNA殘基，結果明顯延緩腫瘤細胞生長並降低了細胞中表達AFP的RNA水平。
3.免疫基因治療免疫基因治療通過基因重組技術增強機體的抗腫瘤免疫功能而達到治療腫瘤的目的。目前有基因疫苗免疫治療、免疫刺激性因子免疫治療、共刺激分子免疫治療、活化的淋巴細胞進行過繼免疫治療、DC為基礎的免疫治療。基因疫苗指的是DNA疫苗，即將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達系統的質粒上，然後將質粒直接導入人或動物體內，讓其在宿主細胞中表達抗原蛋白，誘導機體產生免疫應答。DC是體內最強專職抗原遞呈細胞，能有效刺激靜息的細胞，誘發初次免疫應答，還具有發動和調節抗腫瘤免疫反應的特性。薛剛等[5]套用IFNγ修飾的DC刺激T淋巴細胞，發現IFNγ?DC可促進T細胞增殖，並誘導T細胞向Th1分化。IFNγ的修飾可明顯增強肝癌細胞抗原負載的DC所活化的T細胞對肝癌細胞的殺傷作用。由於IFNγ的修飾能促進DC成熟，增強DC促進T淋巴細胞增殖的作用，誘導細胞免疫，增強T細胞的細胞毒作用，使T細胞能有效地殺傷腫瘤細胞，將VEGFR和Tie 基因共同轉染DC，不僅活化了特異性CTL，還可以阻止腫瘤新生血管生成，從而將腫瘤免疫治療和抗腫瘤新生血管生成治療有效結合起來[6]。
4.抑癌基因治療到目前為止發現的抑癌基因有p53，轉甲狀腺基因及其他抗癌基因和N?ras，C?myc，CEST?2，IGF?ⅡR以及CSF?1等，在所有的抑癌基因中p53基因的突變率較高，它的失活會阻止細胞進入凋亡，從而使之處於持續分裂狀態而增加突變及轉化的機率。通過恢復或添加腫瘤細胞中失活或缺乏的抑癌基因，恢復抑癌基因的功能，從而抑制腫瘤的生長和轉移，常用野生型p53、p16 等。p53基因的突變或者失活不僅使細胞本身周期失調具有致瘤性，並且可以影響細胞對其他凋亡信號如TGF的感受性下降。穆紅等[7]使用p53?cDNA的真核表達質粒p53?pcDNA3對人源性肝癌細胞系HepG2進行轉染，採用RNA原位雜交的方法證明了外源p53?cDNA在HepG2?p53細胞中的轉染和轉錄，成功導入的p53?cDNA可誘導HepG2細胞發生凋亡。p16基因也為抑癌基因，原發性肝癌中p16基因也常表現失活，p16基因能阻抑細胞生長於G1?S期，但不誘發凋亡。p16啟動子甲基化後，肝癌發生機率明顯提高，尤其對於HBV感染者。
5.抗血管生成基因治療腫瘤血管生成是腫瘤生長轉移的關鍵步驟，是促血管生成因子和抑制因子作用失衡的結果。腫瘤血管生成是由腫瘤細胞和腫瘤浸潤炎症細胞，如巨噬細胞或肥大細胞產生的促血管形成因子所介導的。惡性腫瘤的生長和轉移依賴於新生血管的形成，為了不斷地獲得氧和養料，腫瘤細胞就要不斷的分泌促血管形成因子，不少細胞因子與腫瘤血管形成密切相關，因此，抑制腫瘤血管形成可以導致肝癌細胞衰退。腫瘤血管生成中最主要的是血管內皮細胞生長因子(VEGF)。有試驗表明，用脂質體法轉然反義RNA對抗血管內皮生長因子，能夠抑制裸鼠的種植性肝癌的生長[8]。
6.RNA干擾技術的套用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術，也稱為基因沉寂療法，是利用雙鏈RNA(double?stranded RNA，dsRNA)誘發對宿主細胞特異性RNA轉錄的抑制，從抑制特異的基因表達的方法。利用 RNAi技術可同時阻斷多個癌基因的轉錄表達，從而有效抑制腫瘤的生長，達到治療腫瘤的目的。體外RNA干擾技術的主要特點在於其能利用細胞本身的成分，使外源重組干擾片斷能持續轉錄，同時能以一種類似酶促方式對目標mRNA進行切割，從而形成高效、穩定而持久的干擾效應。尿激酶型纖溶酶原激活劑(u?PA)是一種在肝癌細胞中高表達的蛋白，參與機體的多種生理和病理過程，其表達水平與患者的生存呈負相關。李華等[9]構建針對人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)基因siRNA真核表達載體pLXSN?EGFP?U6?siTERT，以hTERT siRNA逆轉錄病毒為表達載體，感染HepG2細胞24、48、72 h後，端粒酶活性分別下降了23.84%、58.03%和85.01%( P<0.05)，感染後24h細胞凋亡29.05%，肝癌細胞生長受到抑制，並存在一定量效和時效關係。除了上述介紹的六種比較經典的基因治療方法外，近年又出現了一些新的基因治療方法。有專家構想利用超聲/微氣泡介導目的基因進入靶組織的靶胞內[10?11]，可以達到靶向性、可控性轉導基因治療的目的，有望成為有實用價值的臨床基因治療技術。不同的基因治療策略聯合套用可相互協同，常採用免疫基因和自殺基因的聯合治療[12]，在增強機體抗腫瘤免疫能力同時直接殺傷腫瘤細胞，達到根治腫瘤的目的。
7.展望目前肝癌的基因治療策略已有很大發展，具有廣闊的套用前景，而早期臨床證據和臨床實驗表明，基因作為一種藥物有重要的地位，將來的發展方向主要集中在下列幾方面：①尋找轉染效率高、基因容量高、毒性小的基因治療載體。近年來，利用超聲對比劑微泡作為基因載體並用超聲技術處理，提高轉染率已取得成功[13?15]；②開發基因，實現可調控的基因轉染系統，以期提高在肝癌組織中的表達陽性率，進行更加精確的基因治療；③設計更具靶向性和安全性的基因轉運系統，尋找肝癌特異轉錄調控元件，從而使外源基因能夠持續、穩定和特異表達，真正實現肝癌的基因治療從動物實驗轉向臨床套用，將是肝癌基因治療的主要研究方向。儘管還存在很多需要解決的問題，但隨著分子生物學及相關學科的發展，我們相信肝癌的基因治療終將會廣泛地套用於臨床。
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