基本介紹
生物反應器是利用酶或生物體（如微生物）所具有的生物功能，在體外進行生化反應的裝置系統，它是一種生物功能模擬機，如發酵罐、固定化酶或固定化細胞反應器等。在酒類、醫藥生產、濃縮果醬、果汁發酵、有機污染物降解方面有重要套用。
內容概述
名稱：生物反應器
主題詞或關鍵字：DNA生命科學細菌胰島素
生物反應器：生物反應器是利用生物體所具有的生物功能，在體外或體內通過生化反應或生物自身的代謝獲得目標產物的裝置系統、細胞、組織器官等等。
內容
生物反應器聽起來有些陌生，基本原理卻相當簡單。胃就是人體內部加工食物的一個複雜生物反應器。食物在胃裡經過各種酶的消化，變成我們能吸收的營養成分。生物工程上的生物反應器是在體外模擬生物體的功能，設計出來用於生產或檢測各種化學品的反應裝置。或者說，生物反應器是利用酶或生物體（如微生物）所具有的生物功能，在體外進行生化反應的裝置系統，是一種生物功能模擬機，如發酵罐、固定化酶或固定化細胞反應器等。
在固定化酶廣泛套用的基礎上，人們發現天然細胞本身就具有多功能的系列化反應系統採用物理或化學方法將細胞固定化，是利用酶或酶系的一條捷徑。一個固定化細胞反應器猶如一台“生命活動功能推動機”。固定化細胞技術開始於70年代，其實際套用程度已超過固定化酶。如美國、歐洲、日本均採用固定化菌體柱床工藝大規模生產高果糖漿。
輸卵管
膜生物反應器1993年英國羅斯林研究所Sang博士研究禽類蛋黃表達系統，在雞蛋的蛋黃里表達了外源蛋白質，由於蛋黃蛋白質是在肝臟細胞表達的蛋白質，而且含量不高；因此，1994年中國科學院微生物研究所、中國轉基因動物學會（籌）副秘書長曾（傑）邦哲提出了禽類轉基因輸卵管生物反應器，在國際上最早開展採用蛋清蛋白質基因側翼序列表達外源藥用蛋白質的研究，1994年11月（Glodegg Plan）和1995年3月及1996年轉基因動物通訊、1995年7月上海首屆國際生物技術與藥物學術研討暨展覽會、1996年11月北京第1屆國際暨第3屆全國轉基因動物學術研討會（秘書長曾邦哲）、1997年生物技術通報發表，並創造了“輸卵管生物反應器（oviduct bioreactor）”一術語與辭彙，以及1999年在德國創建的系統生物科學與工程網站闡述了輸卵管生物反應器（oviduct bioreactor）概念、方法與技術研究。1996年創辦第1屆國際轉基因學術研討會期間，曾邦哲與加拿大、美國、英國、日本有關轉基因禽類實驗室聯繫，但國際上當時沒有人開展這項課題，隨後與美國Avigenics公司和Georgia大學R.Ivarie教授探討了輸卵管生物反應器的合作研究。1998年，美國Avigenics公司獨立開展了規模化投資與研究開發輸卵管生物反應器，因中國科學家曾邦哲已經去了以色列。2002年後，國際國內掀起了輸卵管生物反應器的研究開發熱潮，2003年Science發表了Gloden Egg的評述文章。目前，國際上已有十多家前景看好的公司以輸卵管生物反應器作為拳頭開發產品，約2003年英國羅斯林研究所也創建了公司，並由Sang博士主持研究課題，從禽類蛋黃表達系統轉向了輸卵管生物反應器。輸卵管生物反應器將稱為繼哺乳動物乳腺生物反應器後最具發展前景的動物生物反應器。
同源組織
目前，在同源組織中表達蛋白質最典型的例子是在動物的紅細胞中表達人的血紅蛋白。在人的血紅蛋白基因編碼序列里啟動子有2個CACCC盒，而對應的豬的啟動子裡只有一個，另一個靠近它的是CGCCC盒。Sharma等將豬的β-啟動子與人的β編碼基因融合，並將人的β-基因座調控區（β-LCR）和α、ε基因與融合基因的β基因連線在一起構成載體，轉入豬胚胎細胞，從轉基因豬分泌乳汁中得到的重組人血紅蛋白含量高達32g/L。
生產蛋白
轉基因動物表達重組蛋白多以乳腺、唾液腺和膀胱為靶位。在這些表達器官中，通過構建合適的載體，選擇適當的啟動子和調控序列可產生比正常水平高得多的重組蛋白。不過，生產系統應儘可能與循環系統隔離，以減少表達產物對宿主動物的影響。
乳腺生物
將所需目的基因構建入載體，加上適當的調控序列，轉入動物胚胎細胞，使轉基因動物分泌的乳汁中含有所需要藥用蛋白。從融合基因轉入胚胎細胞到收集蛋白質有一個過程，包括胚胎植入、分娩和轉基因動物的生長。轉基因動物從出生到第一次泌乳，豬、羊、牛各需12、14、16個月；並且只有雌性動物泌乳且不連續，一般可持續2、6、10個月。牛、羊等大型家畜能對藥用蛋白進行正確的後加工，使之具有較高的生物活性，同時產奶量大，易於大規模生產，因而成為乳腺生物反應器理想的動物類型。
抗凝血酶Ⅲ
第一個進入臨床試驗的轉基因蛋白產物是抗凝血酶Ⅲ，將半乳糖β-酪蛋白的啟動子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相連，轉入綿羊胚胎細胞，在轉基因綿羊的乳液中得到有生物活性的蛋白產量可達7g/L。目前該蛋白正用於冠狀動脈旁路手術患者的二期臨床驗證。
β-乳球蛋白
在實驗過程中人們發現牛的β-乳球蛋白（BLG）基因非常穩定，並能在乳腺中特異性表達。Hyttinen等將含有5'端2.8kb和3'端1.9kb的牛BLG基因片段構建成載體，轉入小鼠胚胎細胞，可在轉基因小鼠的乳腺中特異表達高水平的BLG，此外，還發現CpG位點的甲基化程度與BLG的表達量有關，甲基化少的轉基因小鼠乳液中BLG分泌量較大，可達1～2mg/ml，而其他轉基因小鼠分泌量小於0.1mg/ml。
紅細胞生成素
生物反應器（EPO） 目前國內外均採用CHO細胞表達生產人EPO，成本比較昂貴，而用轉基因動物生產的EPO，可能是一條理想的途徑。將EPO dNA分別以HindⅢ和BamHI酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳回收5.4kb的HinⅢ/BamHI片段，插入pGEM-7zf(+）載體，再將867bp的BLG啟動子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位點，構建表達載體pGEM-3zf(+）β-LG-EPO。通過顯微注射方法得到轉基因小鼠乳汗中的EPO含量可達0.5μg/ml。α1-抗胰蛋白酶這也是一個利用BLG基因構建的重組蛋白。將BLG5'末端4.0kb序列與人的α1-抗胰蛋白酶（α1AT）基因的6.5kb片段（去掉第一個內含子）融合，再連線羊的BLG啟動子，以pPOLYⅢ-Ⅰ為載體，轉入羊的胚胎細胞，可在轉基因羊分泌的乳液中得到含量高達60.0mg/ml的重組蛋白α1AT。轉基因在兩年前進入了臨床驗證。
因子Ⅸ
Schnieke等將羊的BLG基因5'末端和人的因子Ⅸ cDNA 與含有BLG複製單元和3'末端的片段融合，將構建的雜合基因轉入羊的胚胎細胞，從分泌的乳汁中得到125μg/ml的重組蛋白。黃淑幀教授等構建了一個含有小鼠MAR元件、牛β-酪蛋白基因調控序列和hFⅨ微基因的hFⅨ乳腺組織特異性表達載體pMCⅨm，其中hF Ⅸ微基因包括全長hF Ⅸ cDNA ，800bp經過改造的內含子1序列和hFⅨ蛋白的信號肽序列。將線形化的表達載體pMC Ⅸm導入羊的受精卵。轉基因羊分泌的乳汁中hFⅨ蛋白的含量約為95ng/ml。在另一實驗中，Yull等將BLG5'末端序列，fⅨ編碼序列和缺失隱性3'端連線點的f Ⅸ3'末端不翻譯區域的一個小片段融合，構成雜合基因，去掉SphI和SmaI位點，克隆入移去了pBJ41的SphI/EcoRV。轉入小鼠胚胎細胞，得到的重組蛋白產量達0.06mg/ml。經過進一步研究，發現是轉基因動物乳腺中對DNA的錯誤剪下使分泌量降低，從而增高重組蛋白產率。在乳腺組織中表達有完全活性的因子Ⅸ是比較成功的，尤其是乳腺組織對因子Ⅸ N端附近的一段含12個葡萄糖殘基的序列進行γ-羧化以保持其活性，而在以前的天然蛋白中沒有發現γ-羧化作用。
因子Ⅷ
人FⅧcDNA長約7.2kb，是目前為止表達的最長cDNA。將它插入小鼠的乳清酸性蛋白（WAP）基因中啟動子（2.5kb）的下游，使之在乳腺中靶向分泌FⅧ重組蛋白。在WAP/FⅧcDNA構建的轉基因小鼠中rFⅧ表達最低，而在轉基因豬中可達1.0～2.7μg/ml。
單克降抗體
Castilla等將編碼了重組單克降抗體（rMab）6A.C3的免疫球蛋白基因cDNA插入小鼠WAP dNA基因組的第一個外顯子，使rMab 6A.C3的表達可以由WAP基因調控序列來控制，將構建的雜合基因注入小鼠胚胎細胞原核，使小鼠乳腺分泌有活性的單克降抗體，這種轉基因表達產物將廣泛套用於預防新生兒腸道感染。
C蛋白
同樣在WAP基因的第一個外顯子位點，Drews等將人C蛋白cDNA插入，轉入小鼠胚胎細胞，可得到產量達1.6mg/ml的重組蛋白。而將上述雜合基因轉入豬的胚胎細胞，可使豬分泌出380μg/mlμg/ml·hr的外源蛋白，活性與人血漿中C蛋白的活性相同。由於C蛋白的抗凝活性依賴於輕鏈膜結合區域正確的γ-羧化，因此，轉基因豬能分泌有活性的C蛋白表明豬的乳腺細胞可對C蛋白前體高速率地進行γ-羧化，以使成熟C蛋白有完整的活性。
優點
1.成本低
2.設備簡單
3.效率高
4.產品作用效果顯著
5.減少工業污染
發展階段
生物反應器（bioreactor）經歷了三個發展階段：細菌基因工程、細胞基因工程、轉基因動物生物反應器。轉基因動物生物反應器的出現之所以受到人們極大的關注，是因為它克服了前兩者的缺陷，即細菌基因工程產物往往不具備生物活性，必須經過糖基化、羥基化等一系列修飾加工後才能成為有效的藥物，而細胞基因工程又因為哺乳動物細胞的培養條件要求相當苛刻、成本太高而限制了規模生產。另外，轉基因動物生物反應器還具有產品質量高、容易提純的特點。一般把目的片段在器官或組織中表達的轉基因動物叫做動物生物反應器。幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可以經過人為馴化為生物反應器。從生產的角度考慮，生物反應器選擇的組織或器官要方便產物的獲得，例如乳腺、膀胱、血液等，由此發展了動物乳腺生物反應器、動物血液生物反應器和動物膀胱生物反應器等。其中，轉基因動物乳腺生物反應器的研究最為引人注目。
轉基因動物生物反應器
用微生物、植物、動物或人細胞，或者用專一性酶通過生物方法將原料轉化為特定產品的容器稱為生物反應器。通常微生物和細胞又涉如何維持它們的環境以提供最佳的生長條件的問題。生物反應器能通過提供合適的條件：例如最佳溫度、pH、有效的底物、營養鹽、維他命和氧（對好氧有機物）來支持這個自然過程，使細胞能進行生長和新陳代謝。生物反應器（bioreactor) 經歷了3 個發展階段細菌基因工程、細胞基因工程、轉基因動物生物反應器。細胞基因工程產物往往不具備生物活性，必須經過糖基化、羥基化等一系列修飾加工後，才能成為有效的藥物，而細胞基因工程又因為哺乳動物細胞的培養條件要求相當苛刻，成本太高，限制了規模生產。動物生物反應器具有產品質量高，容易提純的特點，彌補了其它各類基因表達系統的缺陷。
轉基因動物生物反應器
利用基因工程培育新型微生物轉基因動物是指經人的有意干涉，通過實驗手段，將外源基因導入動物細胞中，穩定地整合到動物基因組中，並能遺傳給子代的動物。Palmiter等（1982）將含有小鼠金屬巰蛋白基因啟動子的DNA片斷與大鼠生長激素基因融合，用微注射的方法導入小鼠受精卵，移植給受體，產下了21 只仔鼠，6 只比同窩仔鼠生長快，10周齡時體重比同窩正常鼠大1 倍，成功地獲得了超級小鼠。這一結果引起世界轟動，轉基因動物的內在潛力由此而得以證實。隨後世界各國普遍開展了轉基因動物的研究，目前已有轉基因小鼠、豬、牛、魚、雞等多種轉基因動物問世。轉基因動物的主要技術步驟包括目的基因的分離與克隆；表達載體的構建；受體細胞的獲得；基因導入；受體動物的選擇及轉基因胚胎的移植；轉基因整合表達的檢測；轉基因動物的性能觀測及轉基因表達產物的分離與純化；轉基因動物的遺傳性能研究以及性能選育；組建轉基因動物新類群
等。轉基因動物最為誘人的前景是利用它生產人類所需要的生物活性產品或藥物。目前世界上有很多公司正在致力於這方面的研究。而轉基因家畜研究最為活躍的領域就是利用它們生產新的動物產品。通常把目的基因在血液循環系統或乳腺中表達的轉基因動物稱為動物生物反應器，把家畜作為一種生物反映器，生產人類所需的藥用蛋白，包括治療用藥物、激素和抗體等。
動物血液生物反應器
近年來，動物血液生物反應器取得了很大進展。血液生物反應器比較適合生產人血紅蛋白、抗體和生產非生物學活性狀態的融合蛋白，而有活性的蛋白或多肽（如激素、細胞分裂素、組織血纖維溶酶因子等）由於進入了動物血液循環系統而影響動物的健康。到目前為止，已有多種通過轉基因動物生產的具有生物學功能的人血紅蛋白問世。
動物的乳腺生物反應器
乳腺生物反應器的原理是外源基因在乳腺特異性表達需要乳蛋白基因的一個啟動子和調控區，即引導泌乳蛋白基因表達的序列，將外源基因置於乳腺特異性調節序列之下，使之在乳腺中表達，通過回收乳汁獲得重要價值的生物活性蛋白。從目前的研究成果看，與傳統的原核系統及細胞發酵系統相比，動物乳腺生產的重組蛋白產品具有以下特點：生物活性高，無污染，純化簡單，產量高，成本低。目前，已克隆並用作構建載體的乳蛋白基因主要有-乳球蛋白（BLG）基因、s1-酪蛋白基因、-酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清蛋白基因。大多數的乳蛋白基因的啟動子已用於外源基因在轉基因動物乳腺中的表達。s1-酪蛋白基因和-乳球蛋白的啟動子尚有未知因素的作用，它們在轉基因動物中表達水平低或表達不穩定。-酪蛋白的啟動子在轉基因動物中表達水平也很低。綿羊-乳球蛋白、山羊酪蛋白和牛s1-酪蛋白啟動子在轉基因動物乳腺中維持異種蛋白的表達水平較高。如果得用目的基因的DNA序列而不是cDNA，表達效果可能會更好。不翻譯的外顯子和內含子的摻入可能有利於
轉基因的表達。值得一提的是，利用乳腺生物反應器生產的“新奇牛奶”已經問世。2003 年，Brophy 等通過共轉染和嘌呤黴素篩選向牛胎兒成纖維細胞引入-s蛋白基因和-酪蛋白基因的多量拷貝，而後進行核移植生產出了8 頭轉基因奶牛，其產奶中酪蛋白總量較普通奶高30%。這種奶的蛋白和鈣含量提高，熱穩定性增強而乳糜顆粒變小，其營養價值更高，也更適於乳酪生產。
優越性
轉基因動物的問世，為利用基因工程手段獲得低成本、高活性和高表達的產物開闢了一條重要途徑。作為生物反應器的轉基因動物，主要是利用其乳腺組織和血液組織進行定位表達，特別是用乳腺組織生產具有生物活性的多肽藥物和具有特殊營養意義的蛋白質，已成為一個新興的轉基因製藥業，它的優越性有如下幾點。3.1 表達產物能充分修飾且具有穩定的生物活性利用DNA重組技術的微生物發酵工程來生產的藥用蛋白,由於細菌等微生物不能進行蛋白質合成後的加工，因而生物活性低，並且具有免疫原性，而利用轉基因動物生產藥用蛋白卻免除這些問題。
成本低可以大規模生產
作為生物反應器的轉基因動物可無限擴繁，且飼養成本低，可進行大規模的藥物生產。而動物細胞生物反應器，雖然能生產具有完全生物活性的產品，但以商業生產為目的的大規模的動物細胞培養，成本會極高且培養條件要求苛刻。
產品質量高易提純
由動物生物反應器生產的藥品為純的生物製品，避免了化學試劑及生物毒素的污染。目前，某些藥用蛋白生產已達每千克乳汁含幾十克，生物活性與天然蛋白幾乎完全一樣，極易提純。總之，動物生物反應器彌補了其它各類基因表達系統的缺陷。
套用
以動物的乳腺或其它組織作為生物反應器生產貴重的醫用蛋白，是動物轉基因技術的另一特殊形式。由於轉基因動物的遺傳結構發生了變化，並能穩定地遺傳給後代，外源基因不僅能在轉基因動物得到整合和表達，而且能獲得組織特異性（乳腺組織）和發育特性（妊娠後期和泌乳期）表達，利用這一點能產生轉基因泌乳家畜，還能生產出目前短缺而又十分珍貴的醫用蛋白。近十年，這方面的研究在英、美、法、瑞士和荷蘭等國家已相繼展開，並取得了一定進展。截至目前，世界一些國家的生物技術企業在利用轉基因動物作生物反應器研究開發的轉基因動物藥品有以下幾種。
組織纖溶酶原激活劑（TPA）：由美國遺傳技術公司（Genentech) 用基因重組技術開發的血栓溶解劑，1987 年11 月經聯邦食品及藥物管理局（FDA）批准上市。1988 年的銷售額為1.5 ～ 1.6 億美元，1989年為1.8 ～ 1.9 億美元。今後每年的市場銷售額約為2 ～ 2.5 億美元。
乳鐵蛋白（lactoferrin): 用轉基因奶牛生產。由於以轉基因奶牛生產乳鐵蛋具備產量高、成本低，以及有無限量增殖生化反應器等特徵，因而備受各國矚目。乳鐵蛋白是一種口服的活性蛋白，自然產生於人乳中，它具有抗菌、傳遞鐵素等特性。
人類-1 抗胰蛋白酶（AAT）：-1 抗胰蛋白酶（AAT）缺乏是最常見的遺傳代謝病，能引起肺和肝的損傷。-1 抗胰蛋白酶（AAT）為呼吸系統的非特異性可溶因子，它可抑制多種酶的活性，包括細菌的酶，以及中性白細胞溶酶體分泌的蛋白質、彈性蛋白酶、膠原酶、纖維蛋白溶酶和凝血酶。這項產品是從英國農業和食品研究委員會的動物生理和遺傳研究院（IAPGR）研究成果為基礎，近年由英國PPL 公司與德國拜耳公司共同嘗試用轉基因綿羊的羊奶生產AAT。
促紅細胞生成素(EPO）：以轉基因豬生產。這種藥物存於轉基因豬的血液中。目前轉基因豬血球素合成的遺傳控制機制已十分清楚，用基因重組技術合成的EPO 已在多個國家上市。
重組人抗凝血酶ii（i atryn）：世界上第一個動物乳腺生物反映器重組蛋白藥物。Atryn的主要成分-重組人抗凝血酶iii 具有抑制血液中凝血酶活性，預防和治療急慢性血栓血塞形成，對治療抗凝血酶缺失症有顯著效果。拒美國權威機構預測，到2010年，轉基因動物生產的重組蛋白產品銷售額將達到350 億美元，生產的藥物將占整個基因工程藥物種類的90%以上。
存在的問題與發展前景
轉基因動物與生物反應器是20 世紀生命科學發展的一個里程碑，但現在仍然存在著許多急需解決的問題。由於轉基因動物的研究在理論和技術上尚有不完善之處，使得轉入的外源基因在動物基因組中隨機整合、調節失控、遺傳不穩定，表達率不高。要提高轉基因的效率，保證外源基因的有效表達，關鍵是基因構建的定點整合。轉基因動物生物反應器的產品的安全性問題。這包括轉基因動物的產物的分離和提純，表達產物的結構和生物活性與人體蛋白的相似性的問題。只有從表達產物除去能引起人類變態反應的非人類蛋白，並且產品與人體蛋白有足夠的相似性，才能套用於人類的健康事業。轉基因動物的成活率低，出生後的部分個體表現出各種生理和免疫缺陷。如為提高生產性能而製備的轉基因豬出現了雌性不育、胃潰瘍和關節炎等病症； 而克隆牛已經先後死去； 轉基因後獲得的目的性狀，通過有性繁殖後，遺傳性狀出現分離，如英國的一隻高產1-AT 羊奶的轉基因綿羊，其子代羊奶中的含僅為其母親的1/10。儘管轉基因動物生物反應器的研究仍面臨著許多需要解決的問題，但它
潛在的社會價值是無可估量的。在未來幾年內，將有多種動物乳腺生物反映器重組蛋白上市，從而形成市場前景廣闊和利潤巨大的新生物製藥行業。
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生命科學儀器
| 生命科學儀器包括分析測試領域、生物技術領域、及實驗室技術領域等。科學儀器的發展和套用，人們對生命科學領域有了更直觀和深刻的了解。基因、克隆、生物晶片等成了熱門話題。 |
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