檢查名稱：淚液乳鐵蛋白
別名：LF
正常值：免疫比濁法：1.04～2.23g/L
臨床意義：降低：乾性角結膜炎
簡介
乳鐵蛋白是一種可以結合鐵離子的糖基化蛋白，它廣泛存在於人體的多種體液和分泌液中，是淚液蛋白中的主要成分之一。它具有抗菌、抗病毒、免疫調節等生理作用，而且它在淚液中的含量還是臨床上診斷乾眼的重要標準。本文就人乳鐵蛋白的生理功能、製備提純以及淚液中乳鐵蛋白的鑑定方法及其在乾眼診斷中的重要作用等方面的研究進展加以綜述。
http://www.nznbl.com乳鐵蛋白（lactoferrin,LF）是一種糖基化蛋白，屬於鐵結合蛋白家族，它能夠可逆性地結合兩個鐵離子，它最早是從牛乳中分離出來，故而得名。人乳鐵蛋白（humanlactoferrin,HLF）分子量約80kDa,等電點約為7.8，由692個胺基酸組成，其多肽鏈分子上附有兩條糖鏈,糖含量約為7%，每個分子上有兩個鐵結合位點[。hLF存在於人體的多種體液和分泌液中如淚液、唾液、乳汁等。淚液LF主要由淚腺分泌產生，少部分來自副淚腺，在淚液中含量豐富，與淚液溶菌酶，淚液前清蛋白以及少量分泌性免疫球蛋白和生長因子共同構成了淚液中蛋白的主要成分。LF具有抗菌、抗病毒、免疫調節等作用，是保護眼表面不受外物入侵的主要防禦力量，其缺失可引起各種眼表疾病。
生理功能
1.1結合功能
乳鐵蛋白可以結合鐵、銅、鈣離子等，而且可與許多蛋白質和DNA結合，如酪蛋白、白蛋白、免疫球蛋白和溶菌酶等。很多細胞的表面都有乳鐵蛋白的受體，乳鐵蛋白和這些細胞結合後能夠發揮抗癌抗微生物的作用。
1.2抗菌功能
乳鐵蛋白具有廣譜的抗菌功能。它能中和細菌的內毒素。由於乳鐵蛋白可以與鐵離子結合，因而能競爭性抑制需鐵的革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌、單細胞李斯特菌等）和陰性菌（如大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌等）。但是也有研究發現，乳鐵蛋白能抑制某些鏈球菌的變異菌株和霍亂菌株，但是這種抑制作用與鐵無關。有學者認為，乳鐵蛋白的抑菌作用源於蛋白中某些胺基酸殘基所帶電荷與細菌細胞膜上的離子相互作用。
1.3抗病毒功能
乳鐵蛋白具有廣泛的抗病毒活性，作用的範圍包括DNA病毒和RNA病毒。研究表明，乳鐵蛋白對C型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)、輪狀病毒(rotavirus)、Friend病毒或Friend病毒複合體(friendviruscomplex,FVC)、脊髓灰質炎病毒(poliovirus)、呼吸道合胞體病毒（respiratorysyncytialvirus)、人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus(HIV)、皰疹病毒(herpesvirus)、巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、阿爾法病毒(alphavirus)、人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)、腺病毒(adenovirus)都有抗性，而且它對病毒的抗性表現在抵抗病毒對細胞表面的吸附作用上，而不是與鐵離子的結合；大部分都是直接和病毒或病毒的受體結合，從而直接消除病毒的入侵能力。
1.4免疫調節功能
乳鐵蛋白具有調節巨噬細胞活性和刺激淋巴細胞合成的能力。目前已發現單核細胞、淋巴細胞、血小板、肝細胞、乳腺表皮細胞、腸上皮細胞的表面都有乳鐵蛋白的受體。乳鐵蛋白能夠與免疫細胞表面的受體結合,從而發揮免疫調節的功能,同時還能夠調節機體細胞因子的水平。
1.5其他功能
此外，乳鐵蛋白還具有抗癌細胞、抑制膽固醇積累、抑制脂質過氧化的功能。近年來還有研究發現，乳鐵蛋白還可作為基因轉移的活化劑和動物細胞促生長因子。
表達與純化
乳鐵蛋白具有抗菌、抗病毒和免疫調控等重要的生物學功能，因此乳鐵蛋白的開發套用早在上個世紀就投入了大量的研究。由於從乳汁中直接分離乳鐵蛋白僅能分離到少量而且成本也較高，尤其是人乳的來源受到很大限制，所以用基因工程的方法如大腸桿菌表達系統、酵母表達系統、桿狀病毒表達系統和乳腺生物反應器等大規模生產將成為未來的發展趨勢。乳鐵蛋白特別是人乳鐵蛋白基因的重組表達已成為近年來研究的熱點。
2.1從乳汁中純化
乳鐵蛋白的胺基酸組成決定了它可以用陰離子交換柱層析的方法來分離純化，過柱後將含有乳鐵蛋白的洗脫液用超濾法濃縮，透析法脫鹽，低溫處理後做成凍乾粉，或者除菌過濾後噴霧乾燥。這種方法是分離純化牛乳鐵蛋白最常用的。利用乳鐵蛋白對某些金屬離子和帶正電物質的親和力，也可以純化乳鐵蛋白。例如，金屬（銅）螯合親和層析法、凝膠過濾層析法、肝素瓊脂糖親和層析法以及單鏈DNA親和層析法。
2.2表達重組人乳鐵蛋白的研究
主要受來源問題的制約，直接從乳汁中純化的方法不適用於人乳鐵蛋白的大量生產，生產成本也比較高。因此，將人乳鐵蛋白基因轉入可以大量繁殖的生物細胞，利用轉基因的生物細胞大量生產人乳鐵蛋白，不失為一種大量生產人乳鐵蛋白的好方法。轉基因生物細胞表達出的人乳鐵蛋白在結構上和天然的人乳鐵蛋白稍有差別，稱為重組人乳鐵蛋白（recombinanthumanlactoferrin,rhLF）。幾十年來，表達重組人乳鐵蛋白的研究已經在多種表達載體上取得了初步的成果。大腸桿菌是套用最早、研究最成熟的表達系統，繁殖速度快，操作方便，但它最大的缺陷在於沒有真核表達系統的糖基化過程，因此表達出的重組蛋白與天然人乳鐵蛋白在結構和活性上有較大差異。加上乳鐵蛋白對大腸桿菌的生長有抑制作用，也不利於表達量的提高。麴黴菌在自然狀態下能分泌糖基化蛋白，因此它成為一種能表達糖基化蛋白的理想宿主細胞，現已用於糖基化蛋白的商業化生產。國外已經有報導，用人乳鐵蛋白基因轉化麴黴菌的基因,再進行適當的改造，獲得較高的表達量[。畢赤氏酵母在糖基化方面很接近人細胞的糖基化方式且能分泌到細胞外，最大程度地使重組的人乳鐵蛋白與天然的人乳鐵蛋白在結構和生物活性上接近。多家單位在這方面進行了研究，方法已經趨於成熟但目前還沒有進行商品化生產。桿狀病毒能普遍感染昆蟲細胞，但不能感染脊椎動物，因此作為真核蛋白表達系統具有安全性。桿狀病毒中存在一種多面體基因，能大量表達，若用人乳鐵蛋白基因代替此基因，可以大大提高蛋白的表達量。此外，轉人乳鐵蛋白基因小鼠，轉人乳鐵蛋白基因牛，轉人乳鐵蛋白基因羊都已經獲得了初步的成功，這些動物的乳汁中含有大量的人乳鐵蛋白，但高等動物基因表達的調控極為複雜，還有待進一步研究。轉人乳鐵蛋白基因的胡蘿蔔、番茄、人參也獲得了初步成果，但表達出的重組人乳鐵蛋白的活性還有待進一步驗證。
淚液乳鐵蛋白與乾眼的診斷
淚液乳鐵蛋白由淚腺、副淚腺分泌，正常淚液的電泳分析表明，淚液中的蛋白主要有淚液前清蛋白、血清白蛋白、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶，還有少量分泌性免疫球蛋白和生長因子[4]。淚液的分泌量與其他體液相比非常小，正常淚液中乳鐵蛋白的含量的在1.14～1.78g/L之間。淚液乳鐵蛋白含量與性別無關，但年齡在20歲以上，隨年齡的增長，淚液乳鐵蛋白含量逐漸降低。反射淚液中的乳鐵蛋白較基礎淚液中的含量高。角結膜乾燥症又稱乾眼，是任何原因引起的淚液質和量異常或動力學異常導致的淚膜穩定性下降，並伴有眼部不適，導致眼表組織病變為特徵的多種疾病的總稱。臨床上乾眼的主要檢查方法淚液分泌實驗（Shirmer試驗）、淚膜破裂時間（BUT）、淚液蕨類試驗、角結膜上皮染色、印跡細胞學檢查[38]、溶菌酶含量、乳鐵蛋白含量等。其中，前兩項檢測是比較快速簡便的方法，也是臨床上最常用的檢測方法[39]。但這兩種方法也有各自的缺點。ShirmerI試驗將測試濾紙放入眼內穹窿部，難以避免一些外界的因素刺激，淚液分泌量不穩定，重複性差。由此判斷乾眼的標準很難確定，增加測試的特異性，敏感度就會降低。BUT測試敏感度很高，但它的特異性較低，也存在類似於ShirmerI試驗的標準確定的問題，因此，BUT也只作為診斷乾眼的參考，它主要是針對淚膜質量的測試[40,41]。劉景祥等研究表明，乾眼症患者淚液中乳鐵蛋白的量明顯下降，而且淚液乳鐵蛋白的含量與ShirmerI試驗成正相關，與BUT也成正相關[42,43]，對乾眼的診斷可以綜合考慮這些檢測結果。在上述這些測試方法中，淚液乳鐵蛋白的含量相對比較穩定，重複性較好，如果在能改進採集淚液的方法，更有利於定量分析，同時提高幹眼診斷的敏感度和特異性，使乾眼的診斷更為準確。
淚液乳鐵蛋白檢測方法
乳鐵蛋白的檢測方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、免疫法[44,45]。分光光度法在475nm處測定吸光值，快速簡便，高效液相色譜法操作簡便，都適用於檢測標本量比較大的樣品；但由於淚液標本的量非常少，因而準確性和特異性差，不適用於淚液中乳鐵蛋白的檢測；相比之下，免疫法準確性高，特異性強，對樣品的純度沒有要求，套用面較廣。通常實驗室使用的免疫學檢測法有免疫擴散法和免疫比濁法。免疫擴散法是將混有乳鐵蛋白抗體的瓊脂糖傾入平板，凝凍後打一些小孔，接入乳鐵蛋白樣品，隨著抗原呈放射形擴散，在以小孔為中心的環狀區域形成抗原—抗體反應沉澱帶，沉澱帶在免疫擴散染色液的作用下被染色，環的直徑與抗原的濃度成正比。免疫比濁法是利用抗原抗體結合反應，測定溶液中抗原抗體結合形成的混濁顆粒對特定波長的光線的吸收量來定量抗原的方法。這兩種方法簡便易行，但靈敏度較低，抗原和抗體的量達不到最佳比值，檢測結果容易出現假陽性。臨床上套用的Lactoplate測試法就是利用免疫擴散法的原理檢測淚液中乳鐵蛋白的含量。它是將直徑4mm的濾紙圓片放入穹窿部5min，濾紙浸濕後取出，做免疫擴散測定，但這種取材方法取出的淚液量很難標準化，無法對淚液中的乳鐵蛋白定量，因此這種方法特異性很低，敏感度也不高[40]。目前最常用的可以定量檢測乳鐵蛋白的方法有酶聯免疫吸附（ELISA）法和放射免疫（RIA）法[4446]。酶聯免疫吸附法結合了抗原抗體特異性反應和酶的高效催化作用，該方法不但可以從細胞水平和亞細胞水平進行抗原抗體的定位，還可以定性或定量地檢測各種抗原或抗體。目前檢測乳鐵蛋白常用的是雙抗體夾心法，即乳鐵蛋白與一抗特異性結合後，再與標記了辣根過氧化物酶的二抗反應，由辣根過氧化物酶催化顯色反應，通過測定反應液在特定波長下的吸光值間接測定乳鐵蛋白的量。放射免疫分析法套用競爭性結合的原理，放射性同素標記抗原（或抗體）與相應抗體（或抗原）結合，通過測定抗原抗體結合物的放射活性判斷結果，可進行超微量分析，敏感性高，常用的同位素有125I和131I。
套用免疫學的方法，需要製備特異性抗乳鐵蛋白的單克隆抗體。單克隆抗體的製備涉及到飼養實驗動物、細胞培養、雜交瘤的篩選等繁瑣工作，周期長且一次製備抗體量有限。虞東芳等[47]利用噬菌體抗體庫技術，可以保存並一次製備大量的抗人乳鐵蛋白單鏈抗體用於雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗中，大大方便了臨床淚液乳鐵蛋白的檢測，降低了檢測成本，為乳鐵蛋白的免疫學檢測技術的發展開闢了新的道路，這種新的方法還需要在臨床實踐中進一步完善。
未來
總之，乾眼症患者在世界人口中都占有相當大的比例，加上環境污染和電腦螢幕輻射的影響越來越大，乾眼症患者有增多的趨勢。因而，對於乾眼的診斷，如何進一步完善淚液乳鐵蛋白的定量檢測，改進取材方法，簡化測試環節，縮短測試時間，增加測試的敏感度和特異性是當務之急。另外，鑒於乳鐵蛋白在人體生理活動中的重要作用以及在醫學和農業方面重大的套用價值，利用基因工程的方法大量製備乳鐵蛋白以及更先進的分離純化方法，簡化製備流程，降低製備的成本，也是眾多研究者今後研究的方向。有研究顯示，乳鐵蛋白能促進受損的角膜上皮細胞的癒合[48,49]，用活性強、過敏性低的重組乳鐵蛋白為人工淚液補充天然淚液的蛋白成分，也有望更好地緩解乾眼患者的症狀，而目前普遍使用的人工淚液中還沒有添加天然蛋白成分[50]，也為人工淚液的研製提供了新的思路。
相關疾病
1.α-地中海貧血（α-地貧；α-海洋性貧血；α-珠蛋白生成障礙貧血）。
2.基底細胞癌（基底細胞上皮瘤；基底樣細胞瘤；侵蝕性潰瘍；基癌；基底上皮細胞癌；basalcellepithelioma；basaloma；basiloma；BCC；BCE；carcinomabasocellulare；hair-matrixcarcinoma）。
3.外源性過敏性肺泡炎（過敏性肺炎；變應性肺泡炎；外源性變應性肺泡炎；allergicalveolitis）。
4.急性嗜酸性粒細胞性肺炎。
5.急性腎盂腎炎。
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7.滋養細胞腫瘤（滋養層細胞疾病；滋養層細胞瘤；滋養葉腫瘤；滋養層腫瘤；致潰瘍性胰島細胞瘤；胃泌素瘤；瘤細胞可分泌胃泌素；trophoblasticdisease；ulcerogenicislettumor；gastrinadenoma）。
8.矽肺（矽肺；石末沉著病；矽肺病；磨工病；肺石末沉著症；grinder'sdisease；pneumosilicosis）。
9.老年人結節病（老年結節病；老年人皮膚多發性良性類肉瘤病；老年人Mortimer病；老年人郝-伯二氏病；老年人伯克肉樣瘤；老年人伯克氏肉樣瘤；老年人肉樣瘤病；老年人肉狀瘤病；老年人類肉狀瘤病；senilemultiplebenignsarcoidosisoftheskin）。
10.老年人胰腺癌（老年胰腺癌；senilecancerofpancreas；senilepancreaticcancer）。
11.胰腺癌。
12.過敏性肺炎（變應性肺炎）。
13.運動誘發哮喘（運動誘發性喘息）。
14.非特異性間質肺炎。
