多肽固相合成法1963年，R.B.Merrifield創立了將胺基酸的C末端固定在不溶性樹脂上，然後在此樹脂上依次縮合胺基酸，延長肽鏈、合成蛋白質的固相合成法，在固相法中，每步反應後只需簡單地洗滌樹脂，便可達到純化目的。克服了經典液相合成法中的每一步產物都需純化的困難，為自動化合成肽奠定了基礎。為此，Merrifield獲得1984年諾貝爾化學獎。固相法得到了很大發展，除了Merrifield所建立的Boc法(Boc：叔丁氧羰基)之外，又發展了Fmoc固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基)。以這兩種方法為基礎的各種肽自動合成儀也相繼出現和發展，並仍在不斷得到改造和完善。
實驗方法
多肽固相合成法本實驗中由苯胺和醋酸經高溫脫水而生成醯胺，由於反應溫度高，會引起反應原料苯胺的氧化，所以此反應中加入還原劑金屬鋅以抑制苯胺的高溫氧化。
本實驗中產品是經水結晶而純化的，結晶是最簡單、有效、經濟的純化手段，結晶時常有少量絮狀物不溶，導致加入過多溶劑形成不飽和溶液，使結晶收率低或不結晶。為此結晶溶液需過濾除去絮狀不溶物雜質，對於遇冷結晶的溶液需保溫過濾。為了得到好的結晶，常需保溫結晶，結晶時間較長。
醯胺鍵是構成生物體內蛋白質的重要共價鍵，是由胺基酸合成多肽、蛋白質類化合物的重要合成方法。本實驗所用的方法條件苛刻，不適用於此類目的。
目前合成多肽的方法主要有液相合成法和固相合成法。在液相肽合成中，每次接肽以後都需要對產物分離純化或結晶以便除去未反應的原料和副產物。這個步驟相當費時間而且麻煩，因操作帶來的損失往往也很大。為了減少這個麻煩並期望能夠使接肽反應自動化，麥瑞菲爾德（Merrifield）於1963年發展成功了固相肽合成方法，他用這個方法獲得了結晶的LeuAlaGlyVal四肽。與之差不多同時，勒辛格（Letsinger）和柯爾內特（Kornet）也用固相載體經不同的化學途徑合成了LeuGly。以後又經過麥瑞菲爾德本人以及其它實驗室對這個方法進行不斷的改進和完善，使之到今天已經成為多肽和蛋白質合成中的一個常用的技術。為此麥瑞菲爾德獲得了1984年諾貝爾化學獎。
固相合成的主要設計思想是：先將所要合成肽鏈的羧末端胺基酸的羧基以共價鍵的結構同一個不溶性的高分子樹脂相連，然後以此結合在固相載體上的胺基酸作為氨基組分經過脫去氨基保護基並同過量的活化羧基組分反應接長肽鏈。這樣的步驟可以重複的多次進行下去，即縮合——洗滌——去保護——中和和洗滌——下一輪縮合，最後達到所需要合成的肽鏈長度。
固相合成反應的基礎是液相合成。由於在液相合成中最普遍採用的是以羧基活化的方式進行接肽，因此在固相合成中也多同樣採用上述的將氨基組分掛在固相樹脂上而向氨端伸長肽鏈的方式，因為這有利於採用過量的活化羧基組分以促使縮合反應接近於完全，而過量的羧基組分則又由於其存在於溶液之中，可以通過過濾和洗滌的方法很容易地除去。
用於肽合成的高分子載體主要有四類。即不同交聯度的聚苯乙烯-苯二乙烯交聯樹脂；不同比例N,N-乙烯基-雙-丙烯醯胺樹脂；聚乙二醇；無交聯的聚苯乙烯。
歷史發展
多肽固相合成法Merrifield所建立的Boc合成法是採用TFA(三氟乙酸)可脫除的Boc為α-氨基保護基，側鏈保護採用苄醇類。合成時將一個Boc－胺基酸衍生物共價交聯到樹脂上，用TFA脫除Boc，用三乙胺中和游離的氨基末端，然後通過Dcc活化、耦聯下一個胺基酸，最終脫保護多採用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法。用Boc法已成功地合成了許多生物大分子，如活性酶、生長因子、人工蛋白等。
多肽是涉及生物體內各種細胞功能的生物活性物質。它是分子結構介於胺基酸和蛋白質之間的一類化合物,由多種胺基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成。到現在，人們已發現和分離出一百多種存在於人體的肽，對於多肽的研究和利用，出現了一個空前的繁榮景象。多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的套用價值。通過多肽全合成可以驗證一個新的多肽的結構；設計新的多肽，用於研究結構與功能的關係；為多肽生物合成反應機制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽藥物等。
多肽的化學合成技術無論是液相法還是固相法都已成熟。近幾十年來，固相法合成多肽更以其省時、省力、省料、便於計算機控制、便於普及推廣的突出優勢而成為肽合成的常規方法並擴展到核苷酸合成等其它有機物領域。本文概述了固相合成的基本原理、實驗過程，對其現狀進行分析並展望了今後的發展趨勢。
從1963年Merrifield發展成功了固相多肽合成方法以來，經過不斷的改進和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質合成中的一個常用技術，表現出了經典液相合成法無法比擬的優點。其基本原理是：先將所要合成肽鏈的羥末端胺基酸的羥基以共價鍵的結構同一個不溶性的高分子樹脂相連，然後以此結合在固相載體上的胺基酸作為氨基組份經過脫去氨基保護基並同過量的活化羧基組分反應，接長肽鏈。重複（縮合→洗滌→去保護→中和及洗滌→下一輪縮合）操作，達到所要合成的肽鏈長度，最後將肽鏈從樹脂上裂解下來，經過純化等處理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保護的稱為BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保護的稱為FMOC固相合成法。
基本原理
多肽固相合成法多肽合成是一個重複添加胺基酸的過程，固相合成順序一般從C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。現在多採用固相合成法，從而大大的減輕了每步產品提純的難度。為了防止副反應的發生，參加反應的胺基酸的側鏈都是保護的。羧基端是游離的，並且在反應之前必須活化。化學合成方法有兩種，即Fmoc和tBoc。由於Fmoc比tBoc存在很多優勢，現在大多採用Fmoc法合成，如圖：
具體合成由下列幾個循環組成：
一、去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用一種鹼性溶劑（piperidine）去 除氨基的保護基團。
二、激活和交聯：下一個胺基酸的羧基被一種活化劑所活化。活化的單體與游離的氨基反應交聯，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反應完成。循環：這兩步反應反覆循環直到合成完成。
三、洗脫和脫保護：多肽從柱上洗脫下來，其保護基團被一種脫保護劑（TFA） 洗脫和脫保護。
條件選擇
Fmoc合成法中的固相載體將固相合成與其他技術分開來的最主要的特徵是固相載體，能用於多肽合成的固相載體必須滿足如下要求：必須包含反應位點（或反應基團），以使肽鏈連在這些位點上，並在以後除去；必須對合成過程中的物理和化學條件穩定；載體必須允許在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸；另外，載體必須允許提供足夠的連線點，以使每單位體積的載體給出有用產量的肽，並且必須儘量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。用於固相法合成多肽的高分子載體主要有三類：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯樹脂、聚丙烯醯胺、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物，這些樹脂只有導入反應基團，才能直接連上（第一個）胺基酸。根據所導入反應基團的不同，又把這些樹脂及樹脂衍生物分為氯甲基樹脂、羧基樹脂、氨基樹脂或醯肼型樹脂。BOC合成法通常選擇氯甲基樹脂，如Merrifield樹脂；FMOC合成法通常選擇羧基樹脂如王氏樹脂。
胺基酸的固定主要是通過保護胺基酸的羧基同樹脂的反應基團之間形成的共價鍵來實現的，形成共價鍵的方法有多種：氯甲基樹脂，通常先製得保護胺基酸的四甲銨鹽或鈉鹽、鉀鹽、銫鹽，然後在適當溫度下，直接同樹脂反應或在合適的有機溶劑如二氧六環、DMF或DMSO中反應；羧基樹脂，則通常加入適當的縮合劑如DCC或羧基二咪唑，使被保護胺基酸與樹脂形成共酯以完成胺基酸的固定；氨基樹脂或醯肼型樹脂，卻是加入適當的縮合劑如DCC後，通過保護胺基酸與樹脂之間形成的醯胺鍵來完成胺基酸的固定。
保護脫除
Fmoc法固相肽合成多肽鏈的主要連線是肽鍵要成功合成具有特定的胺基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成醯胺鍵的氨基和羧基加以保護，同時對胺基酸側鏈上的活性基因也要保護，反應完成後再將保護基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多採用烷氧羰基類型作為α氨基的保護基，因為這樣不易發生消鏇。最早是用苄氧羰基，由於它需要較強的酸解條件才能脫除，所以後來改為叔丁氧羰基（BOC）保護，用TFA（三氟乙酸）脫保護，但不適用含有色氨酸等對酸不穩定的肽類的合成。
1978年，chang Meienlofer和Atherton等人採用Carpino報導的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為α氨基保護基，Fmoc基對酸很穩定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去，近年來，Fmoc合成法得到了廣泛的套用。羧基通常用形成酯基的方法進行保護。甲酯和乙酯是逐步合成中保護羧基的常用方法，可通過皂化除去或轉變為肼以便用於片斷組合；叔丁酯在酸性條件下除去；苄酯常用催化氫化除去。對於合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側鏈功能基的胺基酸的肽來說，為了避免由於側鏈功能團所帶來的副反應，一般也需要用適當的保護基將側鏈基團暫時保護起來。
保護基的選擇既要保證側鏈基團不參與形成醯胺的反應，又要保證在肽合成過程中不受破壞，同時又要保證在最後肽鏈裂解時能被除去。如用三苯甲基保護半胱氨酸的S-，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環用2,2,2-三氟-1-苄氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保護，可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護，用冷的三氟乙酸脫去。
固相中的接肽反應原理與液相中的基本一致，將兩個相應的氨基被保護的及羧基被保護的胺基酸放在溶液內並不形成肽鍵，要形成醯胺鍵，經常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、醯氯或用強的失去劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成醯胺鍵。其中選用DCC、hobt或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法接肽套用最廣。
裂解及合成肽鏈的純化 BOC法用TFA HF裂解和脫側鏈保護基，FMOC法直接用TFA，有時根據條件不同，其它鹼、光解、氟離子和氫解等脫保護方法也被採用。合成肽鏈進一步的精製、分離與純化通常採用高效液相色譜、親和層析、毛細管電泳等。
HPLC分析純化
固相多肽合成樹脂的特徵和進展分析HPLC使用柱子和泵系統，可以經受傳遞高壓，這樣可以用極細的微粒（3-10μ m）做填料。由此多肽要在幾分鐘內高度被分析。
HPLC分兩類：離子交換和反相。 離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH範圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其胺基酸組成表現出相反電荷。分離是一種電荷相互作用，通過可變PH， 離子強度， 或兩者洗脫出多肽，通常， 先用低離子強度的溶液，以後逐漸加強或一步一步加強，直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離。
反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上，用降低離子強度洗脫， 如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到矽上的碳氫烷鏈構成，這種鏈長度為G4-G8碳原子。 由於洗脫是一種疏水作用。大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。 然而，總體實踐中， 這兩類柱互變無多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構成， 比如苯基。
典型的操作常由兩綬沖劑組成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用徑向填柱，那么大小是8×100（3-10μ m）和25×250mm(10μ m)。
大量各種緩衝劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸， 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸鈉/氨，TFA/TEA，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩衝劑，但要注意一點：矽反相柱料不能長時間暴露於高pH，甚至微鹼pH， 因為這樣會破壞柱子。
