簡介
多數轉錄的初始產物無生物活性，在生物體內進行加工處理後才具有生物活性。轉錄後加工（post-transcriptionalmodification）（post-transcriptionalprocessing）:是指將各種前體RNA分子加工轉變成有功能的、成熟的各種RNA(mRNA、rRNA或tRNA等)的過程
基本過程
發展過程σ亞基的替換
在枯草桿菌（B.subtilis）中σ因子廣泛地用於轉錄起始的調節，現知道有10種不同的因子。有的存在營養期細胞中，僅在噬菌體感染的特殊環境，或者從營養生長轉變成孢子形成期。
在處於正常營養生長期的枯草桿菌中發現的RNA聚合酶與E.coli的α2ββˊσ的結構相似，已知σ因子的分子量為43KDa，因而以σ43或σA來表示。它所識別的啟動子帶有的保守順序，與E.coliσ70識別的相似。各種不同的聚合酶含有不同的σ因子，但是數量很少。各種聚合酶識別不同啟動子的-35和-10順序。
從一套基因的轉錄到另一套基因的表達是噬菌體感染的共同特點。噬菌體的發育涉及到感染周期的改變。這些改變通過噬菌體編碼的RNAPol的合成來完成，或者通過噬菌體編碼的控制細菌RNA聚合酶附屬因子（包括新的σ種類）來完成。在枯草桿菌被噬菌體SP01感染中通過產生新的σ因子來控制的。SP01的感染周期通過基因表達的三個階段。在感染的瞬間，噬菌體的早期基因被轉錄了。在4～5分鐘後早期轉錄停了下來，中期基因又開始轉錄。再過8～12分鐘中期基因的轉錄被晚期基因所取代。
早期基因被宿主菌的全酶所轉錄。它們不能區別宿主基因。宿主基因啟動子能被RNA聚合酶α1ββˊα43所識別。
噬菌體基因的表達對於轉錄為中期和晚期基因的轉錄是必要的。有3個調節基因叫28，33和34，它們控制要轉錄的程式。調節的方式是一種級聯調控。在級聯調控中宿主的酶轉錄早期基因，這些基因的產物是轉錄中期基因所必須的。而兩個中期基因編碼的產物又是晚期轉錄所必須的。
早期基因28的突變體不能轉錄中期基因，基因28的產物（稱為gp28）是分子量26KDa的蛋白，它取代核心酶上的σ因子。
這種替代對從早期基因的表達轉為中期基因表達是必要的。它形成的全酶不再能轉錄宿主的基因，而能特異轉錄中期的基因。現在還不清楚gp28怎樣取代σ43，或者宿主的σ多肽究竟發生了什麼情況。
兩個中期基因涉及到一下步的轉錄。無論是基因33還是34若發生突變將會阻止晚期基因的轉錄。這些基因的產物是13KDa和24KDa的蛋白，它們取代了核心的酶上的gp28，現在也還不知道gp33和gp34怎樣排除gp28的（或者排除任何殘餘的宿主σ43），但它們一旦結合到核心酶上，它們就只能在晚期啟動子上起始轉錄。
σ因子的相繼的取代具有雙重的後果，每次亞基的改變使RNA聚合酶能夠識別一組新的基因，而不再識別先前的基因。由於σ因子的轉換使RNA聚合酶的活性全部發生了改變。可能所有的核心酶都是短暫地和不同的σ因子結合，但這種變化的程式是不可逆的。
幾乎大部分σ因子轉換的例子都發生在孢子形成（sporulation）中。不同生活途徑的選擇對某些微生物來說是有利的，在營養期（vegetativephase）來說，對數生長可導致培養基中營養物質的耗盡。此引發了孢子形成；它包括以下幾個階段：（1）DNA複製；（2）在細胞的一端基因組被分離；（3）分離的基因組外包上一層子外殼。在孢子形成的第二階段，細胞產生了兩個獨立的被分隔的部分，這就是母細胞和前孢子（forespore）。這個過程約花8小時，它可以被看成為是一種原始的分化類型。在這種類型中，現代細胞產生兩種發育命運不同的子細胞，一個是母細胞，一個是前孢子，當前孢子被釋放時，母細胞最終被裂解，孢子的結構完全不同於原來的細菌。
孢子的形成涉及到細菌生物合成活性的劇烈的變化。這些變化和很多基因有關。基本的調控仍在轉錄水平。在孢子形成時，一些營養期行使功能的基因被關閉了，但大部分仍繼續表達。另外孢子形成的特異基因僅在這一階段表達。在孢子形成結束時約有40%的細菌mRNA對孢子形成是特異的。
形成的RNA聚合酶在孢子形成的細胞中成為活性狀態，它們含有的核心酶和營養細胞中的是相同的。但附屬蛋白卻不同於營養細胞的σ43。這種轉錄的特異性改變。其原理是在每一間隔中存在著σ因子連續地被新的因子所決代，導致了不同組基因的轉錄。為了協調前孢子和母細胞中轉錄的時間，必須溝通這兩個部分。
當外界環境條件能觸發“磷酸化傳遞”時，孢子形成的級聯調節就起始了。在磷酸化傳遞中一個磷酸基沿著各種蛋白傳遞，直至到達SpoOA（各種基因的產物涉及此過程，這種複雜性可能反應在觸發孢子形成中需要避免發生錯誤）。SpoOA是一種轉錄調節物，其活性受磷酸化的作用。在磷酸化狀態時，它激活兩個操縱子轉錄。而每個操縱子的轉錄是由不同於宿主的RNA聚合酶催化的。在磷酸化SpoOA的指導下，宿主酶利用了一般的σ43來轉錄編碼σF的基因。而宿主酶在較小的因子σH的直接指導下轉錄錄編碼σE的基因，在中隔形成前，這兩種新的σ因子產生了。但到晚些時候才被活化。
σF只有在前孢子的間隔部分才有活性，而在母細胞中它的作用卻被抑制了。在孢子形成的開始，在前孢子中σ45被σF取代了。在σF的指導下，RNA聚合酶轉錄第一套取代了營養期基因的孢子形成基因。營養期基因是先前轉錄的。這種取代反應可能僅存在於RNA聚合酶的群體中。由於σF產生量很少，因此某此營養酶仍保留存在於孢子形成時。被取代的σ45並未破壞，從孢子形成的細胞中的抽提液中σ45仍可得到恢復。通過兩種調節事體才使σF激活。在前孢子中有一種σ因子：σG，它是早期孢子形成基因的產物，它使RNA聚合酶在前孢子中轉錄晚期基因。另一種早期孢子形成基因的產物只負責與母細胞間隔進行溝通。一種信號（通過間隔的蛋白膜）的傳遞來激活σE，σE在先前就已合成了前體的形式（pro-σE），它被剪下後才有活性。
當σE依次導致σK基因轉錄時，上述級聯調控仍在繼續。σK活性的產生是十分複雜的，首先它的基因需要通過重組才能產生。這個因子也是作為一種無活性的前體蛋白（pro-σK）被合成的。它是被一種蛋白酶所激活，一旦σK有了活性，它就取代σE以及導致了母細胞中晚期基因的轉錄。這些事件在母細胞和前孢子兩部分的定時是由一些信號協調的。在前孢子中σG的激活是依賴於母細胞中發生的一些事件。依次激活σG是可以產生一種信號，這種信號穿越過間隔去激活σK。
孢子形成是由兩種級聯調控控制的，在級聯調控中每一間隔部分的σ都相繼被激活，每個σ因子指導一套特殊的基因合成蛋白質。這兩種級聯調控通過一種信號從一個間隔部分傳遞到另一個間隔部分來彼此溝通協調。當一種新的σ因子被激活，原來的σ因子被取代，這樣通過轉移σ因子來打開基因或關閉基因。各種因子結合成RNA聚合酶指揮一套靶基因表達。這些因子的量有效地影響基因表達的水平。在任何時候都有一個以上的σ因子被激活。某些σ因子的特異性是重疊的。現在還不清楚為什麼每個一個σ因子能替換前一個σ因子。
σ因子的替代可以控制起始
E.coliRNA聚合酶轉錄全部細菌的基因，這必定是它能廣泛識別各種啟動子。但與不同啟動子相連結的基因是以不同的水平和在不同的場合被轉錄的。在特殊啟動子上的啟動轉錄的能力是由很多的附屬因子的幫助或者和酶的相互作用來控制的。幾乎沒有一個例子是核心酶亞基本身發生改變來進行調節的。這種機制並非有一種“偏愛”，而是由於這種改變要使RNA聚合酶能特異識別一種類型的啟動子，並阻止其它類型的啟動子，這將減少聚合酶的機動性。在核心酶的亞基之間尚未分工，它們只負責鏈的延伸，而由σ因子來負責位點的選擇，每種不同類型的啟動子都有自己的特異性，那么是否也需要多種不同類型的σ因子呢？
在有些情況下的確存在要σ因子的變換，例如細菌中在孢子形成時就需要變換σ因子。E.coli雖無需經歷如此戲劇性的變化，但它進入靜止生長期時也要經過相當複雜的代謝變化。在一個很長的時間內E.coli只有一個σ因子—σ7，現在又有了新的發現，這些σ因子的命名或根據其產物的分子量，或根據基因。σ32（也稱σN）和σ54（或稱σH）輪流交替被激活，對環境的改變作出反應。σ28（或稱σE）用於正常生長情況下鞭毛基因的表達。但環境發生改變時其表達水平也會發生改變。
當環境溫度增加時，E.coli一反常態改變了它們的轉錄模式，來對“熱休克（heatshock）”作出反應。在很多生物中，無論是原核還是真核生物，對熱休克反應是一種共同類型，溫度升高，通用蛋白質合成開始關閉或下降，而新的一類蛋白卻開始合成。這些新的蛋白是熱休克基因（heatshockgenes）的產物，它的作用是保護細胞，對抗環境的變化。它們的合成是對新的條件如熱休克作出反應。各種熱休克蛋白都屬於分子伴侶（chaperones）。在E.coli中，17種熱休克蛋白的表達都是通過轉錄的改變觸發的，rpoH基因是調節轉錄熱休克反應所必需的。其產物是σ32，其功能是作為一種替換的σ因子，可導致熱休克是基因的轉錄。
另一些σ因子是用於氮飢餓時。E.coli細胞中含有一些小分子蛋白，現稱為σ54，當培養基中缺乏氮時就要用到它。在這種條件下基因打開，允許利用氮源。在細菌中廣泛地發現這種σ因子的副本。因此它具有對環境改變作出反應的機制。
另一種環境引起σ因子變換的情況是σF，它在細胞中存在的量很少，但可導致RNA聚合酶轉錄那些和趨化性有關的基因以及鞭毛的結構基因。在枯草桿菌中它的副本是σD，它可控制鞭毛形成及遊動基因。帶有相同啟動子特異性的因子存在於很多特殊的細菌中。
多種形式的σ因子的存在就進一步使人們思考σ對核心酶的作用是什麼？什麼在負責控制σ因子和核心酶的連結。怎樣有效地決定全酶類型的調節？
我們現在完全不了解在生長的細菌中σ因子之間相互關係的調節。在對環境作出應激反應時（如熱休克或氮飢餓）重新產物新的σ因子，並使用它。假設在熱休克時基因轉錄的選擇依賴於普通的σ70和熱休克σ32之間的平衡，這兩個σ因子共同競爭有效的核心酶，σ32蛋白是不穩定的，它可以迅速地增加或減少，它的不穩定性卻成為調節的重要性能。
每種σ因子都能導致RNA聚合酶起始轉錄一套特殊的啟動子。而每套啟動子可以通過單一順序元件來加以鑑別。每種類型啟動子的順序又是通過RNA聚合酶附加的σ因子直接識別的。在E.coli和涉及枯草桿菌孢子形成中σ因子所負責的那些基因的識別可以推斷起始識別的一般標準。
啟動子對於每種酶來說有一個重要的特點，那就是相同的大小和與起始位點的距離。它們通常僅在-35和-10順序的中心有保守順序。這種保守順序無論是-35還是-10對於每套啟動子來說是不同的。一種酶含有一種特殊的σ因子僅能識別特有的一套啟動子，因此不同蛋白的轉錄都是特異的。這樣一個σ因子被另一上因子所取代，原來的一套基因就會被關閉，新的一套基因就會被打開。
不同的-35和-10保守順序被含有不同σ因子的全酶所識別。這就直接表明亞基它本身必須直接接觸此區的DNA，只有當σ因子被識別了才能通過核心酶的構象間接地發揮功能，但很快使人相信σ能導致核心酶產生系列構象中的一種。而每種構象對不同的啟動子順序來說卻是特異的一種。而每種構象對不同的啟動子順序來說都是特異的。這表明了一個普遍性的原理在σ因子和核心酶之間有一種共同性的關係，σ因子和啟動子的-35及-10順序產生關鏈性的接觸，以這種方式來定位。但現在還沒有解決σ作為一個小分子多肽怎么能復蓋20bp以上跨度的DNA。
比較各種細菌σ因子被鑑別區域的順序結果發現它們是保守的。我們預期這將有重要的意義。σ70有4個區，它們在E.coli中的位點：2區和4區啟動子的-10及-35順序相互作用，2區的其它部分是DNA熔解所需要的。第361～390殘基是和核心酶結合的區域。N-端區是阻止2、4區在缺乏核心酶的情況下與DNA結合。
σ因子和啟動子-35及-10直接接觸的證據來自σ保守區的突變。當啟動子特殊位點是發生突變也會阻止RNA聚合酶的識別。而在σ因子上發生相應的補償突變時就允許聚合酶用於突變的啟動子，從這個實驗中不難推測出DNA中有關的鹼基對和那些被取代的胺基酸接觸。表明2和4（名為2.4和4.2）是涉及到和-10及-35接觸的，這兩個區域在蛋白質中以α-螺鏇的形式存在。
σ的其它部分沒有發現單獨的功能。2區的某些部分具有能與單鏈核酸結合的蛋白相似的順序，推測有可能涉及解鏈。在2區前面和2區開始部分有些重疊，看來這部分是和核心酶相互作用的區域。
當σ70的N-端區域被切除時，這一段截短了的蛋白就能特異地與啟動子順序結合，而完整的σ70卻不能如此，這表明在σ70游離狀態時N-端區域可封閉DNA-結合功能區，但σ70和核心酶結合後改變了σ70的構象，因此能與DNA結合。
在蛋白中用α-螺鏇模體來識別雙鏈DNA順序這是共同的特點。在一個α螺鏇的3～4個胺基酸分開的位點怎樣位於雙螺鏇的同一表面上，而且在某一位點與鹼基相連線。在E.coli和枯草桿菌主要的σ因子中，其Thr和Arg在雙螺鏇的相關位點，並負責和-10順序中的頭兩個位點相接觸還不清楚-10順序的其餘部分如何接觸。實際上σ和DNA之間的接觸範圍以及核心酶和DNA之間的接觸關係還有待於建立。
修飾核心酶、替換σ亞基
T4噬菌體蛋白質合成的時序調節採用了與E.coli及枯草桿菌不同的策略,那就依賴本身攜帶的蛋白對宿主的核心酶加以修飾,改變其和σ亞基的結合能力,乘機將本身編碼的蛋白取代原來的σ亞基,從而改變RNA聚合酶的識別能力。
T4噬菌體在生活周期的不同階段合成不同的mRNA。其主要的兩類是早期mRNA和晚期的mRNA。早期轉錄的有很多基因，它們編碼有關DNA合成、RNA的轉錄調控、重組等的酶；晚期轉錄的是一些編碼噬菌體結構蛋白，粒子裝配以及裂解宿主等的基因。
T4感染伊始是利用宿主的RNA聚合酶轉錄第一批早期mRNA；T4的頭部含有幾種小分子蛋白，稱為內部蛋白。當T4感染不久，這些蛋白伴隨著DNA一道注入到細菌中，其中有一種轉換蛋白是ADP-核糖轉移酶（ADPRT），它可將ADP-核糖（ADPR）連線到宿主RNA聚合酶的α亞基上的精氨酸胍基上使其被修飾，加入一個以上的ADPR，從而降低了RNA核心酶與σ因子的結合能力，而增加了其與T4噬菌體編碼的蛋白Mot的親和力，這樣Mot蛋白取代了σ亞基，使新的RNA聚合酶不再識別寄主的基因和T4早期基因的啟動子。而能識別下一批基因的啟動子。到轉錄晚期同時，RNA聚合酶被進一步地修飾，其兩個α亞基各結合了一個ADPR分子及4個修飾性蛋白。有時稱其為超修飾（hupermodified）的RNA聚合酶。即使如此加工仍不能轉錄晚期基因，要等到DNA複製時才能轉錄，形成了一種程式化的控制。實際上直到複製達到一定階段才需要晚期基因編碼的產物。至於複製時晚期轉錄的調控機理還不清楚，可能改變了晚期基因的構象，使其易於轉錄啟動。
RNA聚合酶的代換
T7噬菌體在轉錄的時序調控中不是採用σ因子的級聯取代,也不是像T4噬菌體那樣對核心酶進行修飾,而是根據自動的感染特點採用了RNA聚合酶的代換來進行時序轉錄的調控。
T7是E.coli的烈性噬菌體，基因組長為39,936nt，順序已知。整個基因組可能具有55個基因，其中44個基因的產物已鑑別出了，已知30種是有功能的轉錄可分為3組，30°C整個生活周期約為25¢分鐘，但其DNA的注入很慢，整個的過程約10分鐘，而其它的噬菌體僅1分鐘即可完成。這也是一種調控的手段，因未注入宿主細胞中的DNA是不能轉錄的。在感染6分鐘後，E.coli的RNA合成體系全部被T4的合成體系所取代。
在感染後的前6分鐘，T7噬菌體的RNAPol尚未表達，因此仍使用了宿主E.coli的RNA聚合酶，轉錄的基因主要有10個（0.3,0.4,0.5,0.6,0.65,0.7,1,1.1,1.2,1.3），其0.3基因編碼宿主限制酶的抑制蛋白，使T7進入宿主免遭降解；0.7基因編碼一種蛋白激酶，能將E.coli的RNA聚合酶磷酸化，為抑制宿主RNAPol作準備；基因1編碼T7RNAPol聚合酶，分子量為98KDa，是一條單鏈肽，它所識別的啟動子是由23bp組成的保守順序（-17～16）。
晚期轉錄分為二組（Ⅱ和Ⅲ）。感染後6～12分鐘後T7就利用自己的RNA聚合酶轉錄第Ⅱ組轉錄物。這一組約含（1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,2,2.5,2.8,3,3.5,3.8,4,5,5.7,6），其中對轉錄調控有關係的是基因2，其產物是E.coli聚合酶抑制劑。宿主的RNA聚合酶先受到基因0.7產物的磷酸化，再經抑制完全失去了作用，此時T7已不再需要I組的轉錄物了，因此廢除了宿主RNA聚合酶的功能，而將自己編碼的RNA聚合酶取而代之。第Ⅱ組的基因多與T7的複製酶系的合成及幾種結構蛋白有關，但第Ⅱ組的啟動子和複製的φL啟動子因其保守順序中分別有2～7個鹼基發生了改變，所以是較弱的啟動子，但由於其位置排在Ⅲ組啟動子的前面，所以先進入宿主得以轉錄，而不與第Ⅲ組啟動子的競爭。
晚期轉錄的另一組基因就是第Ⅲ組轉錄物，它排在最後，故在感染12分鐘後才得以表達。此轉錄物約含15個基因，它們主要編碼頭部蛋白，尾部蛋白以及負責裝配，這樣使得T7噬菌體不至於過早地裝配成粒子。這一組雖排在最後，但啟動子的結構和保守順序完全一致所以是極強的啟動子，從而保證最後階段結構蛋白的合成。
第Ⅰ組轉錄的終止位置在鄰近1.4基因的上游區（1.3和1.4之間），此是E.coliRNA聚合酶的終止子）它解離後T7RNA聚合酶則重新從第Ⅱ組起始轉錄。第Ⅱ組和第Ⅲ組都使用終止子Tj，由於自注入宿主緩慢，在第Ⅱ組轉錄時第Ⅲ組基因尚未注入，仍得不到表達。
Tj的終止效率是90%，尚有10%可以延長轉錄T7的末端，Tj位於基因10和11之間。基因10是主要的頭部蛋白，需要量大，它排在第Ⅱ組末是合理的，即有強啟動子的啟動，又在轉錄後被終止，這樣不僅滿足了裝配顆粒的需要，又不至造成浪費。而排在基因10後面的基因都是編碼少量頭部蛋白和尾部蛋白的，無需大量的轉錄，後面越過Tj延長轉錄的強度就可滿足需要了，這本身也是一種終止子對轉錄的調控。
補充資料
DNA重排對轉錄起始的調控
在真核DNA重排調節轉錄，產生不同的產物的例子是免疫球蛋白以及酵母交配型轉換，而在原核生物中也有通過DNA交替的重排來調節轉錄，最有名的例子就Mu噬菌體的重排以及沙門氏細菌的相轉變。
在沙門氏菌（S.typhimrium）的鞭毛合成中，通過啟動子方向的改變來調節不同鞭毛蛋白的合成。細菌是通過擺動其鞭毛來運動的，許多沙門氏菌因它們具有2個非等位基控制鞭毛蛋白（鞭毛蛋白的亞基）的產生而出現兩相性(diphasic)。同一菌落既可以表達為H1型（細菌處於1相(phase1)），也可以表達為H2型（細菌處於2相（phase2））。在細菌的分裂中有1/1000的機率會出現由一相轉變為另一相，此就稱為相轉變（phasevariation）。
負責合成兩種鞭毛的基因位於不同的染色體座位。鞭毛蛋白的合成的循環調控。H2基因是和另一個rh1基緊密連鎖的，rh1基因編碼H1阻遏物。這兩個基因協調錶達。處於2相時，在H2基因表達的同時，阻遏物基因也得到表達,且阻止了H1基因的合成；在1相時，H2基因和rh1基因都不表達，這樣H1基因就進行合成。在此控制途徑中，細菌的相取決於H2-rh1轉錄單位點否有活性。
這個轉錄單位的活性是由與它相鄰接的一個DNA片段來控制的，此片段長995bp，兩端是長14bp的反向重複順序（TRL和TRR）。H2的起始密碼子在反向重複順序TRR右側16bp處。
含有him基因的DNA片段在TRL（左反向重複順序）和TRR（右反向重複順序之間，其產物Him（hsegmentinversion）蛋白通過反向重複順序之間的互動重組來介導整個片段的倒位。Him基因突變會使倒位的頻率降低104倍。
H2-rh1轉錄單位的啟動子位於倒位片段之中，啟動和轉錄單位方向相同時，轉錄在啟動子處起始，而且持續通過H2-rh1,導致2相的表達。當Him片段倒位時啟動子和轉錄單位方向不同，轉錄單位不能表達，從而導致了1相表達。
在Mu噬菌體中的相關係統是在其基因組右端顯示出一種異乎尋常的特點。在右端有3kb的區域叫做“G”或倒位片段（invertablesegment），在不同的Mu噬菌體的DNA中，這段順序方向不同。在感染E.coliK12品系的Mu噬菌體中，G片段的方向稱為G（+）。經過誘導Mu噬菌體可能含有方向相反的G片段，此稱為G（-）。有一個Mu基因叫做gin（Gsegmentinversion）,正好位於G片段的右側，是倒位反應所必須的。
G片段含有的基因編碼與噬菌體附有關的蛋白。G片段的方向控制著這些基因的表達。噬菌體G片段方向決定了宿主特異性。
Mu噬菌體G片段倒位能產生4種不同的尾絲蛋白。G（+）方向時，S和U基因表達，產物的分子量分別為56KDa和21KDa，這些蛋白可使噬菌體吸附E.colik12菌株，而不吸附E.coliC。G（-）方向時與此相反，基因S´和U´表達,它們產物的分子量分別為48KDa和26KDa，這些蛋白允許噬菌體吸附E.coliC，而不吸附E.coliK12。
這兩類基因編碼順序在兩條互補鏈上，但方向相反。而且由G片段左側的同一個啟動子轉錄。兩種方向的編碼區都需4kb，而G片段本身僅3kb，因此還有1kb與啟動子相聯，在G片段上游鄰接的Sc區（S的恆定區），它是S和S´蛋白N端共有的順序。倒位的部分提供了S蛋白的可變區（Sv和Sv´）。
沙門氏菌中的hin基因和Mu噬菌體的gim基因能以互補的方式相互取代。在E.coli中也發現了相關的基因叫做Pin，它能和Mu噬菌體中gin的突變發生互補的作用。它們催化附近的1.8kb的片段倒位。此片段的兩端有29bp的反向重複順序。我們還不清楚此反應有什麼功能。在P1噬菌體中還有一個cin基因負責C片段的倒位。
gin和him介導的倒位反應在體外進行，但還需要一種尚未鑑別的宿主蛋白，反應的底物必須是超螺鏇。Hin和Gin反應需要另一種順序作為重組位點。此附加順序長60bp，除了重組位點本身靠得太近以外，可以位於底物分子的任何位置。
