簡介
試劑名稱TA載體
國產/進口進口
產地/品牌Santaibio
規格20ul,貨號:STG0010A
參考報價400
銷售商北京啟維益成科技有限公司試劑部
【詳細參數】
貨號：STG0010A
TA載體
－20℃保存六個月
產品包裝：20ul
本試劑盒提供TA(10ng/µl)載體，一種高效的連線緩衝液SolutionI溶液和對照插入片段(660bp)。
產品特點
TA載體用於TA克隆，有以下幾個特點：
（1）快速克隆基因。僅需5分鐘反應的時間；
（2）便於篩選重組子，高克隆效率。提供氨苄青黴素和卡那黴素兩種篩選標記。當某個基因來源於含有氨苄青黴素基因質粒時，可以選擇卡那黴素篩選標記；當某個基因來源於含有卡那黴素質粒時，可以選擇氨苄青黴素篩選標記，降低了克隆背景，對照插入片段克隆效率達95％以上。
（3）容易判斷載體中有無外源基因的插入。包含lacZ基因，在含有IPTG，X-gal的平板培養基上，進行藍白斑篩選，很容易判斷載體中有無外源基因的插入。
使用方法
1.PCR產物的製備
（1）引物要求：引物不需要磷酸化。
（2）酶的選擇：Taq DNA 聚合酶。
（3）反應條件：為了保證擴增產物的完整性，擴增反應需要10～30分鐘後延伸。
反應結束後，電泳檢測PCR產物的量和質量。如果擴增產物有多條帶，凝膠回收目的片段。
2.連線反應體系的建立
在微型離心管中依次加入溶液.
PCRproduct1µl
TAvector(10ng/µl)1µl
輕輕混合，室溫反應5分鐘。反應結束後，將離心管置於冰上。
對於長片段（>2kb），加入1µlSolutionI，補水至總體積6µl。反應時間15~30分鐘。
3.轉化
（1）感受態細胞的選擇
TOP10，TOP10F´，DH5α，DH5α-T1感受態細胞均可用於質粒的轉化。
TOP10，DH5α-T1用於藍白斑篩選時不需加入IPTG，只加X-Gal即可。
TOP10F´，DH5α，用於藍白斑篩選時，需加入IPTG，X-Gal。
（2）轉化
a.加連線產物於50µlTOP10等感受態細胞中（在感受態細胞剛剛解凍時加入連線產物），輕彈混勻，冰浴20分鐘。
b.42℃準確熱擊30秒，立即置於冰上。
c.加250µl平衡至室溫的SOC，200轉，37℃孵育1小時。
d.取8µl500mMIPTG，40µl40mg/mlX-gal混合，均勻地塗於預熱好的平板，在37℃放置30分鐘。
e.待IPTG，X-gal被吸收後，為了便於挑選克隆，取50µl和150µl菌液鋪板，培養過夜。
4．陽性重組子的鑑定和測序
（1）PCR方法鑑定陽性重組子
a.挑選白色和淡藍色的克隆於10µl無菌水中，渦旋混合，25µl反應體系中取1µl混合液用於PCR反應的模板。用M13正向引物和反向引物鑑定重組子。PCR反應條件：94℃預變性10分鐘（裂解細胞，失活核酸酶），94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸（根據片段的大小決定延伸時間）30個循環，72℃後延伸10分鐘。確認包含重組子的克隆，擴大培養，用M13正向引物和反向引物測序。
b.挑選白色和淡藍色的克隆接種於LB/Amp+或LB/Kan+的液體培養基中，過夜培養。PCR方法鑑定分析陽性重組子(同上)，包含重組子的菌液用於測序。
（2）限制性酶切分析陽性重組子
挑選白色和淡藍色的克隆接種於LB/Amp+或LB/Kan+的液體培養基中，過夜培養。鹼裂解法或用試劑盒小量提取質粒，選擇適宜的限制性內切酶，酶切鑑定重組子。
（3）測序
用M13正向和反向引物測序，進行序列分析。
常見問題分析
（1）克隆效率低
影響克隆效率有許多因素，如擴增目的基因所用引物，基因的結構，插入片段和載體的比例等。如發現克隆效率低，嘗試用下列方法提高克隆效率。
a.純化PCR產物。
b.如插入片段的濃度太低，增加插入片段的量（1～4µl）。
c.延長反應時間。
d.重新設計引物，5′端包含“G”，以增加PCR產物3′末端“A”的效率。
（2）PCR鑑定重組子失敗
當用PCR方法鑑定重組子，沒有得到目的擴增產物，又沒有載體自連，說明PCR反應失敗。重新最佳化PCR反應條件或提取質粒，以質粒作模板擴增或酶切鑑定包含重組子的克隆。
（3）重組克隆呈現淡藍色
這是由於插入片段沒有影響lacZ基因讀碼框，這種情況下菌落呈現淡藍色。
