DNA酶切
DNA的限制性內切酶酶切分析
限制性內切酶能特異地結合於一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,並切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴於ATP的存在。Ⅰ類酶結合於識別位點並隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子,然後從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成:一種為限制性內切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列;另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛套用，它們是重組DNA的基礎。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5'-G↓AATTC-3'),有少數酶識別更長的序列或簡併序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位點在對稱軸一側,產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端,如EcoRⅠ切割識別序列後產生兩個互補的粘性末端。
操作步驟
一、DNA酶切反應
1、將清潔乾燥並經滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號,用微量移液槍分別加入DNA1μg和相應的限制性內切酶反應10×緩衝液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內溶液混勻後加入1μl酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關鍵,要防止錯加，漏加。使用限制性內切酶時應儘量減少其離開冰櫃的時間，以免活性降低。
2、混勻反應體系後,將eppendorf管置於適當的支持物上（如插在泡沫塑膠板上）,37℃水浴保溫2-3小時,使酶切反應完全。
3、每管加入2μl0.1mol/LEDTA(pH8.0),混勻,以停止反應,置於冰櫃中保存備用。
二、DNA分子量標準的製備
採用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段來作為電泳時的分子量標準。λDNA為長度約50kb的雙鏈DNA分子,其商品溶液濃度為0.5mg/ml,酶解反應操作如上述。HindIII切割DNA後得到8個片段,長度分別為23.1,9.4,6.6,4.4,2.3,2.0,0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA後得到6個片段,長度分別為21.2,7.4,5.8,5.6,4.9和2.5kb。
三、瓊脂糖凝膠的製備
1、取5×TBE緩衝液20ml加水至200ml,配製成0.5×TBE稀釋緩衝液,待用。
2、膠液的製備：稱取0.4g瓊脂糖,置於200ml錐形瓶中,加入50ml0.5×TBE稀釋緩衝液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動,使附於瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜,以減少水份蒸發。
3、膠板的製備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置於水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg/ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳後再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側,待瓊脂糖溶液凝固後將剩餘的瓊脂糖小心地倒入膠槽內,使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現氣泡。待膠完全凝固後撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然後向槽內加入0.5×TBE稀釋緩衝液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩衝液進入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應注滿緩衝液。
4、加樣：取10μl酶解液與2μl6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。
5、電泳：加完樣後,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓保持在60-80V,電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時,停止電泳。
6、染色：未加EB的膠板在電泳完畢後移入0.5μg/ml的EB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。
7、觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色後的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色螢光條帶。紫光燈下觀察時應戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩,以免損傷眼睛。經照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片後將相機固定於照相架上，採用全色膠片，光圈5.6,曝光時間10-120秒(根據螢光條帶的深淺選擇)。
8、DNA分子量標準曲線的製作：在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點,用卡尺測量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。以核苷酸數的常用對數為縱坐標,以遷移距離為橫坐標,在坐標紙上繪出連結各點的平滑曲線,即為該電泳條件下DNA分子量的標準曲線。
9、DNA酶切片段大小的測定：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離,根據此數值,在DNA分子量標準曲線上查出相應的對數值,進一步計算出各片段的分子量大小(若用單對數坐標紙來繪製標準曲線,則可根據遷移距離直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由標準曲線上查出它預計的遷移距離。
10、DNA酶切片段排列順序的確定：根據單酶切,雙酶切和多酶切的電泳分析結果,對照DNA酶切片段大小的數據進行邏輯推理,然後確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點的相對位置。以環狀圖或直線圖表示,即成該DNA分子的限制性內切酶圖譜。
