病毒形態
CaMV, 1937年由Tomkin首次發現,也是第一個發現植物DNA病毒, 其侵染的宿主范幽狹窄, 主要限於Cruclferae族。在自然條件下通過蚜蟲或葉面摩擦而傳染, 實臉時也可直接以病毒粗提液或病毒DNA磨擦接種。電鏡下觀察病毒可見二十面體的顆粒,直徑50 nm。中子衍射結果表明, DNA夾子二層外殼蛋白之間, 粒子中空, 中心幾乎不含DNA及蛋白質 。
結構特點
CaMV完整DNA為雙鏈環狀, 包裝在病毒顆粒內為松馳環狀, ‘ 而在受染植物細胞粒內抽提到的D N A 分子則以超螺旋或微染色體的形式存在。此DNA分子還有個顯著特點, 即在雙鏈的三個特定位置存在對核酸酶SI 敏感的不連續區( △ l 一△ 3 ) ,其中α鏈( - 鏈) 上有一個, β鏈( + 鏈) 二個, 以熱或鹼處理可得三條單鏈線性D N A , 一條全長,另二條分別為全長的1 / 3 和2 / 3 ,序列分析表明, 不連續區的5 紐末端重複了同一條鏈的3’末端, 從而形成了叄鍵,且有固定的5’末端。
據CaMV完整D N A序列,可推測有八個具轉錄功能的ORF, 依次呈線狀排列,但ORFVIII重疊在ORFV內,且ORFIV與ORFV有較短的交叉 。
結構信息
35S啟動子起始於CaMV 35S RNA轉錄起始點-941至+208的BglⅡ 片段,在位於CaMV 35SDN A中的-46至-105區段存在增強子序列,該啟動子包括TATA盒、CAAT盒、倒轉重複序列和增強子核心序列四個部分。最近發現35S啟動子可以劃分為兩個區域: 從-90 bp至+8 bp為A區域,主要負責在胚根、胚乳及根組織內表達; 區域B(-343至-90 bp)主要控制胚的子葉及成熟植株的葉組織及維管組織內表達。在B區域內的增強子序列可以提高表達水平,如果35S啟動子中存在兩個B區將能使35S啟動子的活性提高10倍,並對異源啟動子也有作用,值得注意的是對某些啟動子, B區起到一個表達的阻遏因子作用 。
改造
在了解CaMV35S 啟動子各種順式作用元件的基礎上, 人們利用它的核心序列構建人工啟動子, 以得到轉錄活性更高的啟動子。研究者利用CaMV35S 核心啟動子與CaMV35S 啟動子的5' 端不同區段和菸草花葉病毒的5'非轉錄區(omega 序列)相連, 發現把兩個CaMV35S 啟動子-419 ～ -90(E12)序列與omega 序列串聯, 在轉基因菸草中GUS 有最大的表達活性.把7個CaMV35S 啟動子的-290 ～ -90(E7)序列與omega 序列串聯, 非常適合驅動外源基因在水稻中表達。用這兩種結構驅動GUS 基因表達, 在轉基因菸草和水稻中GUS 活性比單用CaMV35S 啟動子高20 ～ 70 倍 。
套用及前景
對CaMV35S改造, 使之成為有用的植物基因工程載體。目前的基本戰略為將病毒DNA克隆入細菌質粒, 並重新感染植物; 通過缺失非必需區增加承載外源基因的能力: 檢測外源基因在CaMV宿主中穩定表達的最佳條件, 利用病毒啟動子構建嵌合式載體, 這些研究均巳取得了較大的進展。
CaMVDNA克隆入細菌質粒後, 只要質粒DNA部分能以一定的形式去除,且病毒DNA在宿主內完整, 則不論病毒DNA的結構形式如何, 均有不同程度的侵染性。從感染植物中夯禽到的病毒DNA均重新獲得環狀結構。
CaMV作為植物基因工程載體的第一個成功例子是二氫葉酸還原酶基因取代了病毒的ORFlI而隨整個病毒DNA進人宿主並得到表達。但CaMV直接作為載體仍有其局限性,因為CaMV容納外事基因的空間有限,單純靠改造,病毒DNA本身來擴大基因容量限制較大,其次, 病毒的寄主範圍僅在於十字花科, 對於經濟意義較大的單子葉作物似乎無能為力。因此, 人們正在尋求各種途徑以克服上述的不足。除了缺失CaMV非必需區外, 還缺失一些較大的功能區, 通過野生型CaMV 的共同感染達到互補,如外源基因取代ORFVI後, 通過共同感染, 已運載成功。
利用CaMV的強啟動子(35S promotor)及Poly A信號、Ti質粒片段構建新的載體也是一條有效的途徑, 目前已有許多成功的例子, 35S啟動子已使許多基因在植物內得到表達,如使TMV外殼蛋白的基因在轉基因植物內得到表達, 得到抗病毒植株; 使熒火蟲的發光酶基因進入菸草, 並得到表達。利用35S啟動子與pUC8質粒重組後, 用電穿孔法(electroporation)導入玉米原生質體中, 使抗性基因得到表達。
用病毒作載體的優勢是操作方便,可在植株水平操作, 感染後的植株不僅整株得到感染,而且還可通過蚜蟲或葉面摩擦傳染染而擴大到一片植株。另外,病毒拷貝數較高,使外源基因高效表達。因此把病毒與質粒的優點結合起來, 構成高效表達、穩定、可容性大、寄主範圍廣、操作簡單的載體是很有前途的 。
檢測方法
LAMP 檢測方法
植物轉基因技術是研究和改良植物遺傳資源的強有力工具，其中啟動子是基因表達所必需的，決定了外源基因表達的空間、時間和表達的強度等，是人們定向改造生物的重要限制因素。建立轉基因產品檢測方法，對啟動子進行檢測是最簡單有效的，特別是對於一些未經授權或許可上市，外源基因信息尚未公開的轉基因產品的檢測篩選，對啟動子、終止子的檢測甚至是唯一可行的方法。花椰菜花葉病毒CaMV 的35S 啟動子是轉基因植物中使用頻率最高的啟動子，能在許多植物物種，幾乎所有發育階段及所有組織中高效表達，被廣泛用於構建轉基因植株，如玉米、棉花、大豆、番茄等。35S 啟動子有很多版本，但其保守序列相當穩定，是轉基因檢測的最佳靶點。通過檢測CaMV 35S 啟動子，可篩選產品中是否含有轉基因植物成分。
環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，簡稱LAMP)技術，是一種體外恆溫核酸擴增方法，具有高特異性、高效率和快速靈敏的特點。根據35S啟動子的核酸保守序列設計特異性引物，嘗試建立快速、簡便、靈敏、特異的LAMP 檢測方法，以期成為今後轉基因產品檢測的有效工具。
研究表明，套用所設計的特異性引物，採用LAMP方法檢測35S 啟動子，靈敏度可達0.002%，遠高於歐盟同時也是當前國際上規定的轉基因食品和飼料強制標識的最低含量閾值(0.5%)。對大豆、大米、豆粕等植物原材料及其加工產品，LAMP 檢測法與現行常用的實時螢光PCR 法的檢測結果完全一致。相比之下，該方法對實驗條件要求不高，不需要昂貴的儀器，僅使用恆溫水浴加熱裝置即可完成，因此特別適合基層普及使用 。
高靈敏度電化學發光PCR方法
電化學發光(electrochemiluminescence, ECL)是指通過電化學方法產生一些特殊的物質, 然後這些電生的物質之間或電生物質與其他物質之間進一步反應產生的一種發光現象。它是化學發光與電化學方法相互結合的產物。大多數轉基因植物中使用CaMV35S作為啟動子, 因此可通過檢測該啟動子來判斷植物樣品中是否含有轉基因成分。實驗將高靈敏度電化學發光PCR方法用於檢測轉基因菸草中的CaMV35S啟動子, 將該啟動子的PCR產物與生物素標記的探針雜交, 可以起到特異性篩選產物的作用;與發游標記物——三聯吡啶釕標記的探針雜交, 從而實現電化學發光檢測。兩種探針同時與待測樣品的PCR產物進行雜交, 進一步對樣品進行特異性篩選, 從而提高了檢測的準確性, 避免了假陽性結果的產生。實驗結果表明:該法可以準確的區分待測樣品中是否含有35 S啟動子, 從而區別轉基因菸草和非轉基因菸草。電化學發光PCR方法靈敏度高, 可靠性強, 操作簡便, 結果準確, 有望成為一種高效的轉基因植物檢測方法 。
