簡介
澳大利亞科學家最近發現了一種“抗凍基因”，它能使花草等植物在南極半島零下30攝氏度的低溫環境中生存。研究人員認為，這一發現可以讓人們在冬天也能種莊稼。
澳大利亞維多利亞州拉籌伯大學的吉爾曼·斯潘根伯格教授介紹說，這種基因是從一種名為南極發草的植物中發現的。他說，我們從中識別出了一種特殊種類的基因蛋白，它能防止冰晶生長，因此能避免冰晶給植物帶來的傷害。
研究人員將這種“冰再結晶作用抑制基因”移植到了一株實驗植物中，並且對抗凍基因進行了複製。斯潘根伯格教授表示，現在，我們弄清了它的作用機理，我們可以將這一知識運用到改善農作物、提高其抗寒抗凍性上去。”
該州發展部門的負責人長約翰·布朗比說，全球每年大約有5%至15%的農作物生產受到霜凍的影響。抗凍基因的發現可使因霜凍和寒冷天氣條件造成的數百萬美元的農作物損失得以避免。他說：“在接下來的幾年中，基於對這些抗凍基因功能的分析，我們應該能夠看到農作物抗凍技術的進一步發展和套用。”
無獨有偶，科學家們發現長年生活在寒帶的比目魚不怕凍，因為比目魚的身體裡有一種抗凍蛋白質。科學家將比目魚的抗凍蛋白質基因轉移到西紅柿里，培育出了抗凍西紅柿，這種西紅柿可以在冬季或較寒冷的地區種植，使得人們一年到頭都能吃到西紅柿。
套用
抗凍蛋白質多為糖蛋白，它主要由兩種胺基酸的重複單元構成，可以有效地控制大結晶的生成。 最早人們在南極和北極魚中發現了抗凍蛋白質，這些魚類生活在冰冷的水中而不被凍結，就是因為它們含有抗凍蛋白質，後來研究者又在越冬昆蟲和黑麥類越冬植物中發現了抗凍蛋白質。掌握了抗凍蛋白質的作用機理，人們就能夠用這種知識來對農作物進行改良，增強其抗凍性。
全球每年的農業收成都會因霜凍遭受大約5-15%的損失。在不久的將來，這項新發現將在農業生產中得到發展和套用，它可以為人類挽回數百萬美元的經濟損失。另外，抗凍蛋白質在食品工業中也有著廣闊的套用前景，抗凍蛋白質的添加可有效防止冷凍貯藏中冰結晶的生成，如果在冰淇淋製品中添加微量的抗凍蛋白質，就可對冰晶體的生成形成有效抑制，從而令冰淇淋變得美味可口。
低溫凍害是農業生產中嚴重的自然災害，不僅會限制農作物的栽種範圍，也會造成農作物減產，每年引起的農作物的損失巨大，所以有關植物抗寒性的研究，改造農作物的遺傳特性，使之從凍害中解脫出來，一直都是植物學領域研究的熱點之一，也是科學工作者的理想與追求。用傳統的抗寒育種方法對提高植物抗寒性的作用很小，目前用傳統育種方法得到的最耐寒的小麥品種抗寒能力與20世紀早期所研製的品種抗寒能力基本上一樣。隨著生物技術的發展和廣泛套用，對抗寒分子機理的認識不斷加深，人們開始採用基因工程培育抗寒新品種。
研究進展
溫度是影響植物分布、產量及品質的重要環境因素，提高植物抗凍性對農業生產具有重要的意義。近年來，隨著基因工程的發展，對植物的抗凍性機理進行了深入的研究，並克隆了許多與抗凍性相關的基因。
植物生長發育過程中，溫度作為一個重要的環境因子對其生長、生殖和分布起著關鍵的作用。低溫不僅在很大程度上限制植物的種植範圍，同時還會造成減產和品質下降，嚴重時甚至絕收。全球每年因低溫傷害造成的農作物損失高達數千億元，因此，植物抗寒性研究及抗寒育種一直是植物學研究領域的熱點之一。
現代生物技術的迅猛發展為最終解決植物的抗凍性展現了良好的前景。利用現代分子生物學技術，人們已從植物中克隆出眾多參與植株耐低溫能力形成的基因，研究和分析這些基因的功能，對於揭示植物抗凍性的分子基礎，加速植物抗凍性育種具有重要意義。
1 膜穩定性相關基因
生物膜是植物細胞及細胞器與周圍環境間的一個界面結構，它能夠接受和傳遞環境信息，對環境脅迫做出反應。同時，生物膜對保持植物正常生命活動也具有重要的作用。研究表明，生物膜是低溫冷害作用的首要部位，而且低溫傷害的原初反應發生在生物膜系統類脂分子的相變上。早在20世紀70年代，Lyons就提出“膜相變的寒害"假說，認為植物正常生理活動需要液晶相的膜狀態，在遭受低溫傷害時生物膜首先發生膜脂的物相變化，這時膜脂從液晶相變為凝膠相，膜脂上的脂肪酸鏈由無序排列變為有序排列，膜結合酶的活力降低，且膜上出現孔道或龜裂，使膜的通透性增大，膜內可溶性物質大量向膜外滲透，破壞了細胞內外的離子平衡。同時膜結合酶結構改變，酶促反應速度失去平衡，導致植物細胞生理代謝變化和功能紊亂，從而使植物細胞受到傷害。許多研究表明，膜脂中的類脂和脂肪酸成分的不飽和度明顯影響膜脂的相變溫度。一般認為，膜脂不飽和脂肪酸含量增高，膜脂相變溫度會降低，增加了膜的流動性，從而使植物的抗寒性相應提高。反之，冷敏感植物的膜脂相變可能是由於膜脂脂肪酸的不飽和程度較低，低溫下膜脂由液晶相向凝膠相轉變，造成細胞膜膜相分離，從而引起細胞代謝紊亂。近年來，套用基因工程技術導入脂肪酸去飽和代謝關鍵酶基因，通過降低脂肪酸的飽和度以提高植物抗寒性的研究，已經取得了突破性的進展[8，9]。
日本國立基礎生物化學研究所首先利用脂肪酸去飽和酶基因進行了植物抗寒性的分子改良。1993年，High等[10]篩選了一個膜脂不飽和脂肪酸突變藍藻(SynechocystisPCC6803)菌株fad12，並克隆了Δ12去飽和酶基因desA，研究表明desA基因的表達是由於低溫首先降低了膜脂的流動性，刺激desA的轉錄，使膜脂不飽和度增加，從而增加膜脂的流動性。Los等[11]發現，藍細菌在低溫脅迫過程中，desA基因的表達水平在1h內就增加10倍，抗寒性得到提高。Kodama等[12]將從擬南芥中克隆的葉綠體ω23脂肪酸去飽和酶基因(FAD7)導入菸草中進行表達，轉基因菸草中十六碳三烯酸和十八碳三烯酸含量提高，其前體物質相應減少，在l℃低溫下表現出明顯的抗寒性。Ariizumi等將FAD7基因導入水稻中，獲得的轉基因植株不僅增強了抗寒性，而且也提高了低溫下的光合速率和生長速率。除了FAD7基因外，Gibson等從擬南芥中分離得到另一個受低溫誘導的脂肪酸去飽和酶基因FAD8，編碼合成葉綠體ω23去飽和酶，它與FAD7基因具有75%的核苷酸同源組成，兩者的葉綠體ω23去飽和酶能夠彼此功能互補，共同催化膜脂中脂肪酸的去飽和。此外，John等又從藍細菌和高等植物中克隆了分別編碼Δ6、Δ9以及ω23醯基酯去飽和酶的基因desD、desC和desB，這些基因均具有冷調節特性。Ovkova等將從藍細菌中克隆的Δ9去飽和酶基因des9轉入菸草後，轉基因菸草葉片中不飽和脂肪酸的含量和植株低溫耐受性均有很大的提高。Kwon等克隆了辣椒(Capsicum)葉綠體ω23脂肪酸去飽和酶基因，而且在辣椒基因組中存在一個小的基因家族，該基因在葉片中表達而在根中不表達，當葉片受到傷害時轉錄量迅速提高，並且隨後亞麻酸的含量提高。
脂醯甘油(PG)具有較多的飽和脂肪酸，是決定膜脂相變的主要因素。而甘油232磷酸醯基轉移酶(GPAT)又是PG生物合成過程中的第一個醯基酯化酶，對決定植物膜PG的不飽和度起關鍵作用。目前已獲得多種植物GPAT基因的cDNA或基因組DNA片段。1992年Murata等將冷敏植物南瓜的GPAT酶基因轉至菸草，植株膜脂脂肪酸飽和度增加，相反轉移抗冷植物擬南芥的醯基轉移酶基因，能夠使菸草內囊體PG的脂肪酸組成趨向不飽和，菸草植株抗寒性大大提高。Wolter等將GPAT基因導入菸草和擬南芥，結果改變了其體內磷脂醯基甘油的脂肪酸組成，提高了其不飽和度，增強了抗寒性。Ariizumi等將擬南芥和菠菜的AGPAT和SGPAT基因分別轉化水稻，T1代植株葉片內磷脂醯甘油的順式不飽和脂肪酸含量均明顯高於野生型；同時轉基因植株的鮮重也明顯高於對照。Yokio等將擬南芥的GPAT基因導入水稻中，結果提高了葉片葉綠體膜上PG的不飽和脂肪酸含量，從而增強了水稻的抗寒性。由以上論述可見，利用生物技術的方法改變植物體內脂肪酸代謝途徑，增加不飽和脂肪酸含量，可提高植物的抗寒性。
2 抗氧化酶活性基因
大量研究表明，植物在低溫脅迫過程中，對O2的利用能力降低，多餘的O2則在代謝過程中被轉化成對植物有毒害作用的活性氧(ROS)，打破體內活性氧平衡，從而引發或加劇膜脂過氧化作用，降低膜脂的不飽和度，並可引起膜蛋白的聚合及變性，導致膜脂流動性降低，膜通透性增強，生物膜受損。一定範圍的低溫脅迫下，植物可以動員其自身抗氧化防禦系統清除自由基，調節膜透性及增加膜的結構和功能穩定性，減少細胞傷害。但是這種自身保護具有一定的限度，超出某一範圍即會成為不可逆的傷害，最終致使整株死亡。植物抗氧化防禦系統由包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)等組成。低溫脅迫下這些物質協同作用以去除植物體內的活性氧自由基，其中尤以SOD最為重要，它是植物體內第一個清除活性氧的關鍵抗氧化酶。
近年來，利用基因工程技術通過轉入抗氧化酶基因來提高植物抗寒性已成為研究的熱點。McKersie等將菸草中克隆的Mn2SOD的cDNA置於35S啟動子下轉化到苜蓿的線粒體和葉綠體等細胞器中，提高和增強了轉基因植株中超氧化物歧化酶的含量和活性，並經大田試驗發現大大提高了轉基因植株越冬存活率，同時還增強了對除草劑二苯乙醚的抗性，除草劑對植株的生長抑制明顯減輕。低溫造成菸草株高、葉片數和生物量顯著下降。Gupta等將豌豆的Cu/Zn2SOD基因導入菸草中，發現轉基因植株的葉綠體中SOD基因超量表達，同時也提高了APX的活性，從而增加了菸草抵抗低溫引起光抑制的能力，提高了轉基因植株對凍害的耐受力。Allen等將SOD基因轉入菸草中，增強了菸草的抗氧化能力;將其轉入棉花，也增強了轉基因棉花植株對低溫逆境的抗性。Samis等將Mn2SOD基因導入紫花苜蓿，不僅提高了轉基因植物的膜穩定性，同時還增加了植物的生物量。此外，APX和谷氨醯胺合成酶與植物的抗寒性也有關係。Sato等報導，熱激處理水稻幼苗後可誘導APXa基因的表達，使APX活性升高，從而提高水稻幼苗的抗寒性。Liorente等從水稻基因組中克隆了與POD活性有關的冷誘導基因RCI3，該基因不僅對低溫有很高的耐受性，而且對水分和鹽脅迫也有很好的耐受性。說明利用基因工程手段將抗氧化酶基因轉入植物中，清除植物在低溫脅迫過程中產生的對植物有毒害作用的活性氧物質，能夠提高植物的抗寒性。
3 抗凍蛋白基因
抗凍蛋白(antifreezeprotein，AFP)是一類具有熱滯效應和冰晶生長抑制效應的蛋白質，能以非線性形式降低水溶液的冰點，但對熔點影響甚微，從而導致水溶液的熔點和冰點之間出現差值，它們在受低溫環境脅迫時能使有機體抵禦冰凍環境。抗凍蛋白最早是在極地海魚中發現的，在魚類和昆蟲類中研究比較深入，目前已有將這類基因轉入植物的報導。黃永芬等採用花粉管通道法及子房注射法將美洲擬鰈afp基因導入番茄，田間抗寒性實驗表明，在春季平均氣溫低於正常年份4。4℃的條件下，轉基因植株生長優於對照，致死溫度也比對照降低了2℃。對植物AFP的研究較晚，1992年，加拿大Griffith等首次報導從經過低溫鍛鍊可忍受細胞外結凍的冬黑麥中發現了植物內源性AFP，標誌著植物抗凍蛋白研究的開始，隨後已從多種植物中獲得具有熱滯效應的AFP。1997年Wallis等將植物凝集素基因和AFP基因共同構建到植物轉化載體pKY2LX35S中，之後在轉化馬鈴薯中發現，在-2℃條件下，非轉基因馬鈴薯葉片的電滲值比轉基因馬鈴薯葉片的高2倍多，而且非轉基因植株遭受到了嚴重的凍害。Worrall等從冷誘導的胡蘿蔔中純化出一種分子量為36kD的AFP，並克隆了它的基因，之後將AFP基因導入菸草，所獲得的轉基因菸草提取物能抑制冰晶生長，而且轉基因植株的抗凍性明顯高於對照。1999年，Meyer等[38]採用CaMV35S啟動子，用農桿菌介導胡蘿蔔AFP基因重組子轉化擬南芥，轉基因植物提取液有明顯的抗凍活性，能夠修飾冰晶形態，表明抗凍活性與AFP基因轉錄水平呈正相關。2001年，尹明安等克隆了胡蘿蔔AFP基因，並構建了其植物表達載體，為進一步利用其轉化番茄、甜椒等作物奠定了實驗基礎。Huang等將樹狀抗凍基因DAFP21轉入擬南芥，轉基因植株的抗凍性和對照植株相比提高了0。6~3。3℃。王艷等將準噶爾小胸鱉甲抗凍蛋白基因MPAFP149轉入菸草中，-1℃處理48h，發現轉基因菸草的相對電導率和表型明顯優於野生型菸草。室溫恢複試驗驗證表明，轉基因菸草可存活並恢復生長，而野生型菸草受到了不可逆的低溫凍害。
抗凍蛋白的發現為植物抗寒性研究提供了一條新的途徑，這類蛋白質具有高度的親水性和熱穩定性，能夠保護植物細胞免受低溫傷害。但是目前從植物中分離克隆並能夠用於轉化的植物抗凍蛋白基因並不多，因此今後關於植物抗凍蛋白基因的分離克隆將是植物抗寒基因工程研究的一個熱點。
4 低溫信號轉錄因子
植物在遭受低溫脅迫時，從感受低溫信號到發生一系列生理生化反應和調節基因表達，進而產生抗寒能力，存在一個複雜的信號網路傳導系統，CBF(CRT/DRE2bindingfactor)轉錄因子調控的信號傳導途徑是其中的一個傳導系統，其傳導途徑為：CBF轉錄因子→CRT/DRE基序→COR基因表達→植物抗寒性增加，即轉錄活性因子CBF結合到CRT/DRE基序上，誘導了COR基因表達，從而提高了植物的抗寒性。
1997年，Stocking等首次從擬南芥中分離鑑定出一種編碼轉錄因子的cDNA，這種轉錄因子能識別COR基因中的CRT/DRE元件並與之結合，故命名為CBF1(CRT/DREbindingfactor1)，即CRT/DRE結合因子。將CBF1蛋白基因轉入未經冷馴化的擬南芥中，大量表達後能誘導冷誘導基因在常溫下表達，增強了擬南芥的抗寒能力。後來人們發現擬南芥CBF1基因屬於一個包括CBF1、CBF2、CBF3、CBF4、CBF5和CBF6基因在內的CBF基因家族，該基因家族成員均具有提高植物抗寒性的功能。甄偉等將CBF1基因轉入菸草和油菜基因組中，對轉化的菸草和油菜抗寒性的檢測結果顯示，轉基因油菜的抗寒性有明顯提高，轉基因菸草的抗寒性也有一定提高。Hsieh等將擬南芥的CBF1轉入番茄，轉基因番茄葉片中的過氧化氫酶的活性比對照顯著提高，H2O2含量比對照明顯降低，轉基因植株的抗寒性得到顯著改善。韋善君等將玉米泛素啟動子(Pubi)調控的CBF1基因轉化菸草，發現CBF1組成型表達增強了轉基因菸草的抗寒性。金建鳳等將CBF1基因轉入水稻中，發現低溫處理後轉基因植株體內脯氨酸含量比野生型明顯增加，植株的抗寒性也明顯增強。金萬梅等利用根癌農桿菌介導的方法將擬南芥CBF1基因導入草莓中，提高了草莓對低溫脅迫的抵抗力。擬南芥CBF3基因的過量表達也能夠提高植株耐低溫脅迫的能力，並且導致許多與低溫脅迫有關的生理生化變化，影響脯氨酸和糖的代謝。Song等成功地將外源CBF3基因轉入水稻，提高了轉基因植株對逆境脅迫的抗性。Haake等CBF4基因轉入擬南芥中，並利用35S組成型啟動子使其過量表達，結果使CBF4轉基因擬南芥的抗寒性和抗旱性都大大提高。植物抗寒性是由多基因控制的性狀，往往需要一系列相關基因的共同表達才能提高植物的抗寒性。目前雖然還不知道利用基因工程手段將低溫信號轉錄因子基因轉入植物中誘導了哪些基因的表達，但是在植物抗寒育種中轉入該類基因比轉入單個抗寒基因的套用前景更為廣闊。
5 滲透調節基因
在滲透脅迫過程中，植物體內會產生一些具有保水作用的滲透調節物質來降低植物體內的水勢，從而維持體內的水分平衡。這類滲透調節物質有脯氨酸、甜菜鹼、可溶性糖和醇類物質等。低溫脅迫時，植物通過誘導滲透調節物質的生物合成酶基因的大量表達，以增加這類物質的積累，維持滲透壓的平衡，從而避免低溫傷害。
脯氨酸是水溶性很大的胺基酸，具有較強的水合能力。在植物受到低溫脅迫時，脯氨酸的增加有助於細胞的持水，防止水分散失，起到滲透調節作用。Nanijo將脯氨酸脫氫酶(脯氨酸降解關鍵酶)反義基因AtproDH的cDNA轉入擬南芥，很好地抑制了脯氨酸脫氫酶的產量，提高了胞內脯氨酸水平，增強了植物對低溫和高鹽的耐受性。甜菜鹼是另一類常見的滲透調節物質，其化學性質與脯氨酸相似，它一方面通過與蛋白質的相互作用保護生物大分子在高電解質濃度下不變性，另一方面又可以作為滲透平衡物維持細胞的膨壓。Pilon2Smits等將從細菌(Arrhobacterpasceus)中克隆的膽鹼氧化酶COX基因(甜菜鹼合成途徑中的重要代謝酶)轉入擬南芥、菸草和油菜中，獲得了高甜菜鹼水平的轉基因植株。同時，Pilon2Smits等還發現轉化植株甜菜鹼的積累有助於種子吸脹萌發及幼苗早期生長對低溫的忍耐。Su等將從細菌中克隆到的COX基因轉入到水稻後，發現提高了轉基因水稻葉片中甜菜鹼的濃度，轉基因植株對鹽和低溫有較強的忍耐性。Kumar等將甜菜鹼醛脫氫酶BADH基因(甜菜鹼合成途徑中的另一重要代謝酶)轉入胡蘿蔔後，發現轉基因植株對低溫和鹽脅迫的能力明顯增強。果聚糖是一種多聚果糖分子，因其良好的水溶性而具有調節滲透壓的功能。Huang等將桿菌(Bacillussubtilis)編碼果聚糖的基因SacB轉入菸草，結果轉基因菸草表現出比對照更強的抗滲透脅迫能力;王關林等將從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中分離克隆的果聚糖合酶基因SacB導入番茄中，抗凍實驗結果證明，轉果聚糖合酶基因的番茄具有良好的抗寒性。隨著分子生物學的發展，許多與滲透調節物質代謝有關的基因被克隆，將這些基因導入植物中，增加這類滲透調節物質在轉基因植物中的含量，以提高其抗寒性，這在植物抗寒育種中顯示了較大的套用潛力。
展望
隨著對植物抗寒分子機理的深入研究，分子生物學及生物化學技術的不斷發展，為低溫相關基因的克隆及其套用研究奠定了堅實的基礎，利用基因工程使植物獲得抗寒性成為植物抗寒育種最有效的途徑之一。但由於植物抗寒基因工程是一個新興研究領域，研究基礎比較薄弱，還有許多問題有待進一步研究：
(1)抗寒基因工程大多是圍繞單個基因研究，但植物的抗寒性是由多基因控制的性狀，僅靠轉移1個基因就獲得抗寒的植物比較困難，轉化單基因植株抗寒性提高的程度相當有限，因此必須轉移多個基因，但目前同時轉化多個基因的技術還不成熟。(2)可利用的目的基因不多。植物的抗寒性受一個龐大的調控網路控制，涉及大量的基因，而目前分離的主要是一些保護類的基因，且多來自擬南芥等模式植物。要想植物的抗寒育種取得更大的突破，必須從不同的植物分離更多的基因，深入研究植物的抗寒分子機理。
(3)轉基因的表達系統不完善。目前，抗寒基因工程多採用CaMV的35S組成型強啟動子來啟動外源基因在植物體內的組成型表達，雖在逆境下能較好地提高植物抗寒水平，但在非逆境下，這種不必要的高表達也給植物帶來許多負面效應。首先，外源基因過強表達會消耗大量的能量，將會導致轉基因植物在正常環境下都會出現生長被嚴重延滯的現象；其次，在無寒凍脅迫的時候，外源基因表達也是不需要的，因此這類啟動子不能作為植物抗寒基因工程中最適啟動子長期使用。解決這一問題的關鍵在於尋找植物內源特異性啟動子，從而使抗性基因在低溫脅迫時能誘導大量表達的同時，又不影響轉基因植物的正常生長發育。相信隨著分子生物學技術和方法的不斷發展，用基因工程方法提高農作物的抗寒性必將取得可喜的進展，並將具有廣泛的實際套用前景。
