概述
柱層析技術也稱柱色譜技術。一根柱子裡先填充不溶性基質形成固定相，將蛋白質混合樣品加到柱子上後用特別的溶劑洗脫，溶劑組成流動相。在樣品從柱子上洗脫下來的過程中，根據蛋白質混合物中各組分在固定向和流動相中的分配係數不同經過多次反覆分配，將不同蛋白組分逐一分離。
根據填充基質和樣品分配交換原理不同，離子交換層析，凝膠過濾層析和親和層析是三種分離蛋白質的經典層析技術。
常說的過柱子應該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以矽膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。由於柱分的經驗成分太多，所以下面我就幾年來過柱的體會寫些心得，希望能有所幫助。
柱子分類
柱子可以分為：加壓，常壓，減壓
壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。
減壓柱能夠減少矽膠的使用量，感覺能夠節省一半甚至更多，但是由於大量的空氣通過矽膠會使溶劑揮發（有時在柱子外面有水汽凝結），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時間長）。以前曾經大量的過減壓柱，對它有比較深厚的感情，但是自從嘗試了加壓後，就幾乎再也沒動過減壓的念頭了。
加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。個人覺得加壓柱在普通的有機化合物的分離中是比較適用的。
柱子的尺寸
應該是粗長的最好。柱子長了，相應的塔板數就高。柱子粗了，上樣後樣品的原點就小（反映在柱子上就是樣品層比較薄），這樣相對的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二厘米，那么分離的難度可想而知，恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。而如果樣品層只有0.5厘米，那么各組分就比較容易得到完全分離了。當然採用粗大的柱子要犧牲比較多的矽膠和溶劑了，不過這些成本相對於產品來說也許就不算什麼了（有些不環保的說，不過溶劑回收重蒸後也就減小了部分浪費）。
現在見到的柱子徑高比一般在1：5～10，書中寫矽膠量是樣品量的30～40倍，具體的選擇要具體分析。如果所需組分和雜質分的比較開（是指在所需組分rf在0.2～0.4，雜質相差0.1以上），就可以少用矽膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我覺得可以增加柱子的直徑，比如用3cm的，也可以減小淋洗劑的極性等等。
關於無水無氧柱
適用於對氧，水敏感，易分解的產品，可以濕柱，也可以乾柱。不過在樣品之前至少要用溶劑把柱子飽和一次，因為溶劑和矽膠飽和時放出的熱量有可能是產品分解，畢竟要分離的是敏感的東東，小心不為過。也是因為分離的東西比較敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至於是加壓、常壓、減壓，隨需而定。因為是schlenk操作，所以點板是個問題，如果樣品是顯色的，恭喜了，不用點板，直接看柱子上的色帶就行了。如果樣品無色，只好準備幾十個schlenk瓶，一瓶一瓶的點，不過幾次之後就知道樣品在哪，也就可以省些了。像我以前過一根無水無氧柱，需要六個schlenk，現在只一個就能把所要的全收集到。
無水無氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。因為矽膠中有大量的羥基裸露在外，很容易是樣品分解，特別是金屬有機化合物和含磷化合物。而氧化鋁可以做成鹼性、中性和酸性的，選擇餘地比較大，但是比矽膠要貴些。聽說有個方法，就是用石英做柱子，然後用HF254做固定相，這樣在柱子外面用紫外燈一照就知道產品在哪裡了，沒有驗證過。哪位做過可以提出來大家參詳參詳。
濕法、乾法上樣
濕法省事，一般用淋洗劑溶解樣品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶劑越少越好，不然溶劑就成了淋洗劑了。很多樣品在上柱前是粘乎乎的，一般沒關係。可是有的上樣後在矽膠上又會析出，這一般都是比較大量的樣品才會出現，是因為矽膠對樣品的吸附飽和，而樣品本身又是比較好的固體才會發生，這就應該先重結晶，得到大部分的產品後再柱分，如果不能重結晶，那就不管它了，直接過就是了，樣品隨著淋洗劑流動會溶解的。
有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑又不能上柱（比如DMF,DMSO等，會隨著溶劑一起走，顯色是一個很長的脫尾），這時就必須用乾法上柱了。樣品和矽膠的量有一種說法是1：1，我覺得是越少越好，但是要保證在鏇乾後，不能看到明顯的固體顆粒（那說明有的樣品沒有吸附在矽膠上）。
溶劑的選擇
當然是最便宜，最安全，最環保的了。所以大多選用石油醚，乙酸乙酯。文獻中有寫用正己烷的，太貴了，除非特別需要不要用不然銀子嘩嘩的，流的比淋洗劑還快，不過因為極性很小，有時還是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡覺，注意保持清醒別讓溶劑流幹了，那樣柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和矽膠的吸附是一個放熱過程，所以夏天的時候經常會在柱子裡產生氣泡，天氣冷的時候會好一些。甲醇據說能溶解部分的矽膠，所以產品如果想過元素分析的話要留神，應該經過後繼處理，比如說重結晶等。其他的溶劑用的相對較少，要依個人的不同需要選擇了。
由於某些原因，用到的淋洗劑多是大包裝的（便宜嘛），我們這裡是用10升或25升的塑膠桶裝的，就要注意這些工業品的純度是較低的。經常能夠從送來的大桶底部看見有色的雜質，其他的雜質就可想而知了，所以在比較嚴格的柱分時就要對溶劑重蒸。當然過原料時就可以免去這一步了，反正下面還有提純的方法。
另外溶劑在過柱子後最好也回收使用，一方面環保，另一方面也能節省部分經費，缺點是要消耗一定的人工。這裡要注意的是，一般在過柱同時進行的是減壓鏇蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由於揮發度的不同會導致極性的變化，一般會使得極性變大，在梯度淋洗時比較合適，正好極性越來越大了。在過完柱子後，溶劑最後回收要採用常壓，因為在減壓鏇蒸時會有部分低沸點的雜質一起出來，常壓時就會減少這種現象，如果雜質和你下面要過的樣品有反應那就慘了。
操作問題
1、裝柱
柱子下面的活塞一定不要塗潤滑劑，會被淋洗劑帶到產品中的，可以採用四氟節門的。乾法和濕法裝柱覺得沒什麼區別，只要能把柱子裝實就行。裝完的柱子應該要適度的緊密（太密了淋洗劑走的太慢），一定要均勻（不然樣品就會從一側斜著下來）。書中寫的都是不能見到氣泡，我覺得在大多數情況下有些小氣泡沒太大的影響，一加壓氣泡就全下來了。當然如果你裝的柱子總是有氣泡就說明需要多練習了。但是柱子更忌諱的是開裂，甭管豎的還是橫的，都會影響分離效果，甚至作廢！
2、加樣
用少量的溶劑溶樣品加樣，加完後將下面的活塞打開，待溶劑層下降至石英砂面時，再加少量的低極性溶劑，然後再打開活塞，如此兩三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑，一開始不要加壓，等溶樣品的溶劑和樣品層有一段距離（2～4cm就夠了），再加壓，這樣避免了溶劑（如二氯甲烷等）夾帶樣品快速下行。
3、淋洗劑的選擇
感覺上要使所需點在rf0.2～0.3左右的比較好。不要認為在板上爬高了分的比較開，過柱子就用那種極性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分開，因為柱子是一個多次爬板的狀態，可以通過公式的比較：0.6/0.8一次的分離度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。
4、樣品的收集
用矽膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。所以如果樣品與矽膠的吸附比較強的話，就不容易流出。這樣就會發生，後面的點先出，而前面的點後出。這時可以採用氧化鋁作固定相。另外，收集的試管大小要以樣品量而定，特別是小量樣品，如果用大試管，可能一根就收到了三個樣品，wuwu。如果都用小試管那工作量又太大。
5、最後的處理
柱分後的產品，由於使用了大量的溶劑，其中的雜質也會累積到產品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶劑洗滌一下，因為大部分的雜質是溶在溶劑里的，一洗基本就沒了，必要時進行重結晶。
另外，再過柱的時候，有時會出現氣泡，一是和使用的溶劑有關，如果是易揮發的溶劑，如乙醚、二氯甲烷等，在室溫稍高的情況下，很容易出現這種現象，因此，在室溫高的時候，可以選擇沸點較高，揮發相對小的溶劑。還有，使用混合溶劑時，使用的兩種溶劑的沸點應該相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚(60~90),而乙醚卻要選擇30－60的石油醚。二是：不論是用帶砂板的還是塞棉花的，在裝柱之前，都要將空氣用加壓的方法將空氣排乾，這樣就可避免柱中有空氣！
