末端酶系統

基因工程中的工具酶主要是指用於DNA和RNA分子的切割、連線、聚合、修飾、反轉錄等有關的各種酶系統。

末端酶系統

酶系統

末端酶系統

限制性核酸內切酶(RE)

是一類由細菌產生的能專一識別雙鏈DNA中的特定鹼基序列、並水解該點磷酸二酯鍵的核酸內切酶，簡稱限制酶或切割酶。

根據限制酶的作用特性，一般分為三類：

——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。

限制酶（Ⅱ型）識別及切割位點

特異識別及切割48個bp長度且具有迴文序列的DNA片斷，主要產生3種缺口：5ˊ－粘性末端 3ˊ－粘性末端

平端或鈍端

迴文序列

是指該部位的核苷酸序列呈180O旋轉對稱;

粘性末端

是指經內切酶特異切割後產生的5ˊ－末端突出或3ˊ－末端突出的鹼基序列相互具有互補性。

⑴產生5'-粘性末端

⑵產生3'-粘性末端

⑶產生平(頭末)端/鈍端

末端酶系統

其它特殊性質的Ⅱ型限制酶同裂酶（異源同工酶）、同尾酶、可變酶、同裂酶，又稱異源同工酶。指來源不同，但具有相同的識別序列。

在切割DNA時，其切割點可以是相同的，產生平頭末端，稱為同識同切；

切割點也可以是不同的，產生3ˊ或5ˊ粘性末端，稱為同識異切。

同裂酶——同識同切、同裂酶——同識異切、同尾酶、同尾酶，指來源不同，但識別與切割順序有一定的相關性的一類酶。它們作用後產生相同的粘性末端。

可變酶

末端酶系統

識別順序中的一個或幾個鹼基是可變的，並且識別順序往往超過6個鹼基對。如，BstpⅠ，其識別順序為GGTNACC。

DNA聚合酶

（最常用的DNA聚合酶有以下4種）

DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段、TaqDNA聚合酶、T4噬菌體DNA聚合酶、一DNA聚合酶Ⅰ

E.ColiDNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）是一個具有3種酶活性的多功能性酶。

包括：5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性、5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性、3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性DNApolⅠ套用⑴催化DNA缺口平移反應，製備高比活性DNA探針；⑵第二條cDNA鏈的合成；⑶對DNA3’突出末端進行標記；⑷DNA序列分析。E.coliDNApol.Ⅰ催化切口平移二Klenow片段（DNApol.大片斷）Klenow片段用途⑴補齊雙鏈DNA的3ˊ末端；⑵用標記鹼基補齊3ˊ末端；⑶在cDNA克隆中，用於第二股鏈的合成；⑷DNA序列分析。三TaqDNApol（耐熱DNA聚合酶）

作用特點

（1）TaqDNApol催化DNA合成的最適溫度範圍7075℃，（2）95℃以上高溫，半小時不失活，（3）最適合用於聚合酶鏈反應（PCR）。

逆轉錄酶

末端酶系統

特點

逆轉錄酶是一個多功能性酶，至少具有以下3種酶活性：

⑴以單鏈RNA為模板，催化合成cDNA單鏈

⑵具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA雜交鏈中的

RNA

⑶以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈。

逆轉錄酶的套用

⑴將mRNA逆轉錄成cDNA，構建cDNA文庫；

⑵補平和標記5ˊ-末端突出的DNA片段；

⑶代替Klenow酶用於DNA序列分析；

⑷製備雜交探針等。

DNA連線酶(DNAligase)

DNA連線酶可以催化帶有粘性末端或平頭末端的雙鏈DNA中一條鏈的3ˊ－OH與另一條鏈的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯鍵而相連，從而構成一條完整的DNA長鏈。