排阻限

一般選用排阻限度略大於樣品中最高分子量物質的凝膠,層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部,由於Kd不同,最後得到分離。 凝膠柱的製備凝膠型號選定後,將乾膠顆粒懸浮於5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹,溶脹之後將極細的小顆粒傾瀉出去。 自然溶脹費時較長,加熱可使溶脹加速,即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸,1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。

凝膠的選擇根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開,由於它們在分配係數上有顯著差異,這種分離又稱組別分離,一般可選用SephadexG-25和G-50,對於小和低分子量的物質(1000-5000)的脫鹽可使用SephadexG-10,G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離,這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大於樣品中最高分子量物質的凝膠,層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部,由於Kd不同,最後得到分離。

基本介紹

排阻限度 - 簡介柱的直徑與長度根據經驗,組別分離時,大多採用2-30cm長的層析柱,分級分離時,一般需要100cm左右長的層析柱,其直徑在1-5cm範圍內,小於1cm產生管壁效應,大於5cm則稀釋現象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間,但對移動慢的物質宜在30-40之間。
凝膠柱的製備凝膠型號選定後,將乾膠顆粒懸浮於5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹,溶脹之後將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長,加熱可使溶脹加速,即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸,1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節省時間又可消毒。
凝膠的裝填:將層析柱與地面垂直固定在架子上,下端流出口用夾子夾緊,柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器,柱內充滿洗脫液,將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛於柱頂的容器中,然後在微微地攪拌下使凝膠下沉於柱內,這樣凝膠粒水平上升,直到所需高度為止,拆除柱頂裝置,用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間,再開始流動平衡,流速應低於層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速,千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜,使用前要檢查層析床是否均勻,有無“紋路”或氣泡,或加一些有色物質來觀察色帶的移動,如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好,色帶出現歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。
加樣和洗脫凝膠床經過平衡後,在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和,再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大於凝膠總床體積的5%-10%。樣品濃度與分配係數無關,故樣品濃度可以提高,但分子量較大的物質,溶液的粘度將隨濃度增加而增大,使分子運動受限,故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2.樣品加入後打開流出口,使樣品滲入凝膠床內,當樣品液面恰與凝膠床表面相平時,再加入數毫升洗脫液中洗管壁,使其全部進入凝膠床後,將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連,預先設計好流速,然後分部收集洗脫液,並對每一餾份做定性、定量測定。
凝膠柱的重複使用、凝膠回收與保存一次裝柱後可以反覆使用,不必特殊處理,並不影響分離效果。為了防止凝如果不再使用可將其回收,一般方法是將凝膠用水沖洗乾淨濾乾,依次用70%、90%、95%乙醇脫水平衡至乙醇濃度達90%以上,濾乾,再用醚洗去乙醇、濾乾、乾燥保存。濕態保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性,密封后高壓滅菌保存。

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