脊神經根切斷術,原癌基因蛋白質,fos,網狀結構目的
將選擇性脊神經後根切斷作為刺激源，觀察刺激後不同時間點大鼠脊髓腰膨大以及腦幹網狀結構抑制區和易化區興奮神經元細胞核中c—Fos蛋白表達的差異，探討其對神經元活性和功能的影響。方法：實驗於2004—02/06在鄭州大學人體解剖學教研室完成。將成年Wistar大鼠64隻隨機分為脊神經後根切斷組（n=24），假手術組（n=24）和正常對照組（n=16）。①模型製作：取背部正中切口，在×10手術顯微鏡下咬除腰1和腰2椎板，分離左側腰3-6脊神經後根，並切斷2mm。假手術組只暴露脊髓，不進行脊神經後根切斷。②組織切片的製備：分別於術後1，2，6和12h相應的時間點，對各組動物進行心臟灌注後，取動物脊髓的腰膨大和腦幹部，連續冠狀切片，按Paxinos和Watson圖譜進行組織核團定位。③免疫組織化學法染色後，在光鏡下進行細胞計數和攝影。④細胞計數：光鏡下對各切片的免疫陽性細胞進行計數,c-Fos蛋白陽性表達判定標準為細胞核染成深棕色，胞漿未染色，神經細胞無形態輪廓顯示。每隻大鼠觀察腰膨大6張切片，分別計數左側脊髓灰質板層Ⅰ～Ⅵ內c-Fos蛋白陽性表達細胞核的數量；觀察網狀結構抑制區和易化區切片6張，計數陽性標記細胞核數量。結果：脊神經後根切斷組動物在手術後有2隻死亡，隨即進行了補充，納入最後分析的動物為24隻；假手術組動物24隻，正常對照組動物16隻，全部進入統計分析。①各組大鼠左側腰髓3-6灰質板層Ⅰ～Ⅵ c—Fos的表達：脊神經後根切斷組脊髓損傷後1，2，6，12h時間點均有明顯表達，主要集中在Ⅰ～Ⅲ板層；假手術組在1，2，6h有少量表達；對照組在各個時間點基本無表達。脊神經後根切斷組在各個時間點的表達均高於與假手術組和對照組，差異有顯著性。②各組大鼠右側腦幹網狀結構c—Fos的表達：在抑制區，各組各個時間點均無明顯表達。在易化區，脊神經後根切斷組可見大量c-Fos蛋白陽性細胞表達，假手術組有散在細胞表達，對照組基本無表達。脊神經後根切斷組在各個時間點的表達均高於與假手術組和對照組，差異有顯著性。結論：本實驗觀察到選擇性脊神經後根切斷可引起大鼠同側腰髓灰質后角和對側腦幹網狀結構易化區c—Fos的大量表達脊神經後根切斷和網狀結構易化區神經元功能的改變存在著密切的聯繫。結合易化區的功能，推測脊神經後根的切斷改變了網狀結構抑制區和易化區神經元的活性狀態，從而通過網狀結構的傳出纖維影響各個運動核團，降低了相應核團的興奮性，從而緩解了痙攣的過程。 觀察大鼠腦幹網狀結構抑制區巨細胞網狀核與腦幹眼球外肌運動神經核的纖維聯繫。方法：將2種神經元示蹤劑麥芽凝集素-辣根過氧化物酶＇-雙十八烷--四甲基吲哚羰花青-高氯酸鹽（DiI）分別注入大鼠左側巨細胞網狀核後,鏡下觀察示蹤劑在腦幹眼球外肌運動神經核的分布。結果：WGA-HRP逆行標記神經元胞體及順行標記神經纖維終末出現於雙側動眼神經核、滑車神經核,標記胞體同側多於對側;動眼神經核小細胞部也發現逆行標記細胞;展神經核未見標記。2種示蹤劑顯示結果基本一研究成年大鼠延髓巨細胞網狀核與腦幹內臟運動核的神經聯繫。方法 將順、逆行神經示蹤劑WGA- HRP注入一側巨細胞網狀核，光學顯微鏡下觀察該核團與一般內臟運動核（迷走神經背核、上泌涎核、下泌涎核）和特殊內臟運動核（面神經核、 疑核、三叉神經運動核）的纖維聯繫。結果 在一般內臟運動核、雙側迷走神經背核、下泌涎核均可 看到少量逆行標記細胞及神經纖維末梢，但上泌涎核未發現任何標記，在特殊內臟運動核的面神經核、疑核、三叉神經運動 核團雙側均見逆行標記細胞及神經纖維終支。 結論 巨細胞網狀核與大多數腦幹內臟運動核有雙向纖維聯繫。巨細胞網狀核;神經示蹤劑;迷走神經背核;疑核;大鼠
經典神經解剖學清楚地闡述了位於腦幹抑制區的巨細胞網狀核（gigantocellular reticular nucleus）通過網狀脊髓束的神經支配對骨骼肌起抑制效應。根據諸多基礎及臨床研究，其對肢體協調運動的抑制性 調控作用已被醫學界公認。近年來隨著人們對功能認識相對空白的腦幹網狀結構這一區域的深入了解，不斷發現巨細胞網狀核的其他調控作用。比如其對心血管、呼吸等內臟活動有不同程度的影響，認為該核 團所在區域屬於降低血壓的“降壓區”及調節呼吸節律的吸氣中樞。臨床痙攣性腦癱患者由於中樞抑制與興奮調節失衡，產生軀體運動及胃腸道功能障礙，這些都說明巨細胞網狀核與內臟活動有著某些聯繫，國內外研究內臟運動核與巨細胞網狀核相關聯繫的資料較少，本實驗主要觀察該核團與直接調控內臟活 動的腦神經核團間的神經聯繫，說明它與內臟活動有關 180～220 g Wistar大鼠30隻，雌雄不限。4%WGA-HRP（溶液）購自美國Sigma公司，四甲基聯苯胺（TMB）為美國Research公司產品，二甲基亞碸（DMSO）為美國Merck公司產品，亞硝基鐵氰化鈉（SNF）、鎢酸鈉（ST）均為美國Sigma公司產品。江灣Ⅰ型C腦立體定位儀，CM1800恆冷冰凍切片機，C09 - A4772型微量注射器，90型牙科鑽，P-30型 微玻管拉制儀，德國Leica光學顯微鏡及數碼攝影 裝置。大鼠在戊巴比妥鈉（50 mg·。kg-1）或水合氯醛（500 mg。 kg-1）腹腔注射全麻下，通過兩側耳桿和齒栓將大鼠頭部固定於腦立體定位儀，剪毛，消毒，在大鼠頭部 切一正中切口，分離皮下組織，充分暴露顱骨前囟到人字縫後1cm ，按照Paxinos和Watson大鼠腦立體定點陣圖譜定位Gi（圖譜中巨細胞網狀核的縮寫），以顱骨中線左側或右側旁開1 mm與外耳道連線後方2.8 mm 交匯處為圓心（Gi中心點坐標）鑽一小孔，清除此孔內腦膜及少量溢出的腦脊液，將前端套好微玻管（已吸入WGA-HRP）的1 μl微量注射器固定在定位儀推進桿上，按上述坐標使微玻管尖端從腦表面向下小心推進7.6 mm，緩慢注入4%WGA-HRP 0.05～0.10 μl，留針20 min，緩慢起針，縫合。有28隻動物存活2～4 d （少數為4d ），在麻醉狀態下，經左心室快速灌流20～25 ℃生理鹽水100 ml衝去血液，繼而灌入4 ℃體積分數為4%多聚甲醛及1.25%戊二醛的0.1 mol ·L-1磷 酸緩衝液（PBS，pH7.4）固定，打開顱骨，迅速取出整個腦組織，後固定4 h，再入4℃ 20%蔗糖PBS液沉底，截取腦幹部分，冰凍冠狀連續切片，厚40 μm，隔1取1，注射部位附近切片全取，切片收集於裝有0.01 mol·L-1PBS液的孵育盒，其中10隻動物切片按Mesu- lam1978年推薦的TMB-SNF法［7］顯色，另外18隻動物切片用TMB-ST法［8］ 顯色。整個顯色反應過程注 意避光。將反應後的切片順次貼在塗抹鉻釩明膠的載玻片上，避光晾乾，切片收集2套，其中1套中性紅復染，用於對照觀察和定位核團。過梯度酒精、二甲苯，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察並記錄、拍片低倍鏡下檢查注射部位，其中以Gi中心為圓點向周圍擴散但未超出該核外圍的共23組，觀察這23組切片注射部位和相應內臟運動核。注射部位大致呈卵圓形，由內向外分三層環繞中心，最內層的中心有不同程度破潰壞死組織，周圍呈淺 藍色環形區帶;毗鄰層藍黑色，含較多顯色反應顆粒，但細胞形態難以分辨;最外層顏色較淺，向周圍輻射，可見輪廓清晰的神經細胞胞體及突起。標記細胞及纖維終末的分布
一般內臟運動核:迷走神經背核、下泌涎核雙側均可見逆行標記細胞和順行纖維終末，但上泌涎核沒有標記。迷走神經背核標記細胞胞體大致呈鐮刀形、橢圓形，個體中小型，標記細胞數目較多，每張切片4～6個;下泌涎核多為小型梭形細胞，標記細胞數目較少，每張切片1～3個，兩核團順行標記纖維終末分布稀疏 。特殊內臟運動核:面神經核、疑核、三叉神經運動 核雙側均見逆行標記細胞和順行纖維終末。面神經核標記細胞多為鐮刀形、扁長形，中等大小，標記細胞和纖維終末較多，每張切片7～10個;疑核大致為三角形，中等大小，每張1～3個切片;三叉神經運動核呈叉形、鐮刀形胞體，個體較大，每張切片2～4個;後兩者纖維終末標記都不多。
本實驗結果表明，巨細胞網狀核與這些直接調控內臟活動的運動神經核有相互作用，間接反映Gi對內臟活動有影響，科研和臨床病例觀察說明 該核團是神經衝動傳遞的中繼站，在高級到低級中樞神經系統中起承上啟下的作用，本實驗也說明中樞神經系統對機體其他活動調控（除協調軀體運動）方面，Gi也參與其中，但具體作用模式還有待繼續探究。本實驗套用兩種顯色方法，體會要獲得滿意的呈色結果，比如標記細胞顯色分明，非特異性沉澱少，TMB-ST法的控制條件更容易掌握且標記效果好。相比之下TMB-SNF法有如下不足:（1）需要的孵育液 等的配製較繁瑣;（2）要嚴格注意避光，否則標記物很 容易見光分解褪色;（3）需SNF做穩定劑，切片標記物保持時間短。
【參考資料】[1]all.zcom.com/mag2/yixue/linchuangyixue/20
