LpxC抑制物抗菌

LpxC是一種胞質鋅金屬酶[8],催化類脂A生物合成的第2步,也是關鍵性的一步(圖1),即從3-醯基-2-乙醯-氨基葡萄糖上脫去一個N-乙醯基團。從不同的菌種中得到LpxC的序列比較得出10個His,Asp,Glu保守殘基可能在催化中起作用。通過測定胺基酸的定點突變對催化活性的影響,3個His和1個Asp是保持催化活性所必需的[9]。Jackman等[9, 10]對LpxC進行結構分析證實:它含有1個單獨的催化性的鋅離子,與2個組氨酸殘基氮結合,再結合1個組氨酸氮或天冬氨酸或谷氨酸形成羧酸酯,同時還結合1個水分子。LpxC由lpxC基因編碼,它的整體摺疊屬於α+β家族。整個結構由16個殘基連線的2個結構域組成,每個結構域包含5個β摺疊片和2個主要的a螺旋。2個結構域的2級拓撲結構已被鑑別出,活性位點定位於2個結構域的界面,兩側為一些小的亞結構域,如:βββ,βαβ等[11]。McClerren等[12]通過研究類脂A合成過程中LpxC的動力學數據發現,LpxC中Glu73作為去質子化的廣義鹼,激活鋅離子結合水。而Marey等[13]研究發現,LpxC的脫乙醯酶催化活性是通過Glu78和His265的酸鹼催化及鋅離子結合水的親和試劑作用實現的。

抑制劑

針對LpxC設計的最早的抑制劑是苯唑啉基羥肟酸(phenyloxazoline-based hydroxamates)類抑制劑。此類抑制劑是根據鋅金屬酶的共性而設計的,通過羥肟酸與鋅離子的相互吸引使抑制劑與催化性的鋅離子結合,以取代鋅離子所結合的水分子而起到抑制作用。在早期的研究中發現,將羥肟酸基團改變為1個羧基,所有的LpxC抑制活性和抗菌活性全部消失[5]。最早的此類抑制劑是L-573,655和LNTI-229,實驗結果表明,在30 ℃,pH 5.5條件下,以UDP-3-O(R-羥基十四醯)-N-乙醯氨基葡萄糖作底物,該類抑制劑對大腸桿菌LpxC有明顯的抑制作用。特別是LNTI-229,其對於野生型大腸桿菌的抗菌活性與氨苄青黴素相當,但在同樣條件下,該類物質對A.aeolicus LpxC的活性無明顯抑制作用。此類抑制劑對普遍人類病原菌銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)幾乎也不顯示抗菌活性[4]。為了尋找一類廣譜的LpxC抑制劑,研究人員進行了多次嘗試。Chen等[14]在化學方面,對這類含有苯環、唑啉環羥肟酸功能基團的化合物進行了一些修飾,主要是對苯環或唑啉環進行酯化修飾,或是對一些對映體進行研究,但未取得明顯效果。近來Amander等報導了一種可與LpxC進行緩慢緊密結合的抑制劑CHIR-090,它的抗菌活性與環丙沙星相當。CHIR-090與A.aeolicus LpxC的結合分為2步:第1步是非常迅速的可逆反應;第2步需要一個緩慢的不可逆的轉變過程[15],底物的積累不會影響這種緩慢的過程,因而不能解除抑制作用.

底物類似物羥肟酸類抑制劑

苯唑啉基化合物L-573,655和LNTI-229對E coli的抑制需要羥肟酸基團的存在,為了尋找廣譜的酶活性抑制劑,Jackman等合成了一系列包含羥肟酸功能基團的LpxC底物的類似物。這些潛在的酶抑制劑包含一個四氫吡喃環,對應於LpxC底物的N-乙醯基團被羥肟酸取代。在相同條件下,TU-514和TU-517的抑制效果最好。TU-514在體外高效抑制多種LpxC,包括E.coli和A.aeolicus LpxC,卻有很少或沒有抗菌活性,因為他們不能透過陰性菌的外膜。TU-514與AaLpxC形成的複合物結構揭示出一種新型的ab摺疊和一種獨特的鋅離子結合模型。複合物形成過程中AaLpxC的疏水通道捕獲了TU-514的醯基鏈[9, 17]。Gennadios等[18]對LpxC與TU-514形成的複合物進行X射線晶體結構研究,發現TU-514的羥肟酸基團與Zn2+形成螯合體,同時與保守活性位點的Glu78,His265,Thr191胺基酸殘基以氫鍵結合。抑制物TU-514 C-4位的羥基與Glu197,His58形成氫鍵,而C-3位的豆蔻酸鹽則與活性位點的疏水通道相結合。這些分子間相互作用的闡明為了解酶-底物(抑制劑)間的結合提供了指導。在E.coli中LpxC底物葡萄糖環3-OH位置連線不同的醯基鏈,已製備出不同的底物類似物抑制劑,並且實驗結果顯示,對E.coli和A.aeolicus LpxC的抑制性依賴於醯基鏈的長度,隨醯鏈的變短抑制活性降低甚至喪失。其他的一些底物類似物是用酮、羧酸酮或是三氟甲基酮類基團取代羥肟酸部分,但均不顯示抑制活性。以前的研究發現像嗜熱菌蛋白酶、羧肽酶A、膠原酶等許多鋅離子金屬酶可被含有磷酸酯(鹽)基團的化合物所抑制[19],因此設計了此類化合物6SHT55進行實驗,發現含有亞磷酸酯的與底物類似物6SHT55相似的IC50,對E.coli和A.aeolicus LpxC都有抑制作用,而且6SHT55的抑制活性不具有時間依賴性。儘管在E.coli中含亞磷酸酯的6SHT55對LpxC的抑制效果不如含羥肟酸的抑制物,但對於A.aeolicus LpxC來說,6SHT55是一種較好的抑制劑,這說明亞磷酸酯取代物在某些時候可以擴大抑制範圍.

結語

苯唑啉基羥肟酸類抑制劑在體外和動物模型中均顯示抑菌作用,但作用範圍較小,不能作為廣譜的抗菌試劑使用。LpxC底物類似物的抑制劑,在體外對E.coli LpxC的抑制接近於LNTI-229,但對野生型E.coli的抑制活性卻不十分明顯。表明此類化合物可能不能進入細胞,或是在細胞中被代謝後排出。但這類抑制劑體外幾乎對所有革蘭陰性菌的LpxC有抑制作用,支持LpxC保留有共同的結構特徵的說法。一種廣譜的抑制劑應作用於LpxC的保守結構區和酶活性位點表面。抑制劑對LpxC的識別主要是與鋅離子作用,目前已研究出多種此類的抑制劑。其次是識別活性位點的保守表面,主要是疏水通道。設計專一作用於疏水通道的潛在的抑制劑是今後研究的一個方向。Kline等[20]對P.aeruginosa LpxC抑制物的研究和Mdluli等對P. aeruginosa LpxC的分子確認研究的數據提示,P. aeruginosa LpxC可作為新型抗菌藥物的靶點,為臨床重要的革蘭陰性菌抗菌試劑的設計提供指導[21]。隨著LpxC酶的動力學和酶-抑制劑結合拓撲學研究的深入,有望設計出療效明顯、毒副反應低、價格低廉的抗內毒素感染的理想藥物