實時逆轉錄聚合酶鏈反應

實時逆轉錄聚合酶鏈反應，提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，採用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。

逆轉錄-聚合酶鏈反應 (Reverse transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，採用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用於：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。
一、反轉錄酶的選擇
1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。
2． 禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶：在Mn存在下，允許高溫反轉錄RNA，以消除RNA模板的二級結構。
4．MMLV反轉錄酶的RNase H突變體：商品名為SuperScript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。
二、合成cDNA引物的選擇
1． 隨機六聚體引物：當特定mRNA由於含有使反轉錄酶終止的序列而難於拷貝其全長序列時，可採用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源於rRNA。
2． Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3’端Poly(A)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。由於Poly(A)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和複雜性方面均要小。
3． 特異性引物：最特異的引發方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反套用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。
二、 試劑準備
1．RMA提取試劑
2．第一鏈cDNA合成試劑盒
3．dNTPmix：含datp、dCTP、dGTP、DTTP各2mM
4．Taq DNA聚合酶
三、操作步驟
1. 總RNA的提取：見相關內容。
2. cDNA第一鏈的合成：目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。現以GIBICOL公司提供的SuperScript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。
（1）在0.5ml微量離心管中，加入總RNA 1-5μg，補充適量的DEPC H2O使總體積達11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，輕輕混勻、離心。
（2）70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。
然後加入下列試劑的混合物：
10×PCR buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTPmix 1μl
0.1M DTT 2μl
輕輕混勻，離心。42℃孵育2-5min。
（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
（4）於70℃加熱15min以終止反應。
（5）將管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解殘留的RNA。-20℃保存備用。
3．PCR：
（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列試劑：
第一鏈cDNA 2μl
上游引物（10pM） 2μl
下游引物（10pM） 2μl
dNTP(2mM) 4μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶（2u/μl） 1μl
（２） 加入適量的ddH2O，使總體積達50μl。輕輕混勻，離心。
（３） 設定PCR程式。在適當的溫度參數下擴增28-32個循環。為了保證實驗結果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內參（如G3PD）的特異性引物，同時擴增內參DNA，作為對照。
（４） 電泳鑑定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。
（５） 密度掃描、結果分析：採用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描。
四、注意事項
1． 在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。
2． 為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。
3． 內參的設定：主要為了用於靶RNA的定量。常用的內參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在於避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。
4． PCR不能進入平台期，出現平台效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數量有關。故對於每一個目標序列出現平台效應的循環數，均應通過單獨實驗來確定。
5． 防止DNA的污染：
（１） 採用DNA酶處理RNA樣品。
（２） 在可能的情況下，將PCR引物置於基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。