家畜育種者
微衛星標記在家畜遺傳育種研究中的套用
更新：2008-7-29來源:第一食品網作者:佚名【大中小】
微衛星標記作為繼RFLP之後的第二代分子標記，越來越受到研究者的青睞。本文就其特徵、優點及在家畜遺傳育種中的套用作一綜述。
自20世紀70年代以來，人們就已經知道了真核生物基因組中微衛星的存在，然而直到1982年Hamada等人在酵母至脊椎動物中均發現poly（dT-dG）n核心序列的多拷貝之後，人們對微衛星數量之多、分布之廣才有了深入了解[1]。近年來，隨著PCR技術及凝膠檢測方法的不斷發展與更新，微衛星標記越來越受到研究者的青睞，並發展成為繼RFLP之後的第二代分子標記。
經典的家畜遺傳育種研究中的形態性狀標記因其自身固有的一些特點而在某種程度上已經不能滿足現代遺傳育種研究的需要，而分子標記的湧現則為家畜遺傳育種研究帶來了新的契機。近年來，微衛星標記以其獨特的優點和特點而被廣泛套用於家畜遺傳育種研究的各個領域。本文就微衛星標記的特徵、優點及其在家畜遺傳育種中的套用作一介紹。
1．微衛星標記的特徵及其產生機理
微衛星，又稱簡單序列重複（Simplesequencerepeats，SSR），是指以少數幾個核苷酸（1～10個，多數為2～4個）為單位多次串聯重複的DNA序列。微衛星標記由核心序列和兩側保守的側翼序列構成。保守的側翼序列使微衛星特異地定位於染色體某一區域，核心序列重複數的差異則形成微衛星的高度多態性[2]。
根據微衛星的結構，Weber等將其分為三類，即完全的（Perfect）、不完全的（Imperfect）和複合的（Compound）微衛星。完全的微衛星是指由不中斷的重複單位構成的微衛星；不完全的微衛星其重複序列中間有3個以下的非重複鹼基，兩側不中斷的部分重複數大於3；複合的微衛星則指兩類或兩類以上的串聯重複單位由3個連續的非重複鹼基分隔開，但不中斷的重複單位的重複數不小於5[3]。
關於微衛星的產生機制，普遍認為是DNA複製過程中滑動，或DNA複製和修復時滑動鏈與互補鏈鹼基錯配，導致一個或幾個重複單位的插入或缺失。Valdas等認為從統計學角度看，微衛星的產生採用的是逐步突變模式（Stepwisemutationmodel，SSM），即每一次突變均增加一個或數個重複單位，從而導致一個新的等位基因的出現[4]。微衛星的功能目前尚不甚明了，但已發現微衛星能參與遺傳物質的結構改變，基因調控及細胞分化等過程，有自身特異性結合蛋白，還能直接編碼蛋白質，是一種非常活躍的鹼基序列。
2．微衛星標記的優點
2.1分布廣泛
微衛星廣泛分布於真核生物基因組中，不僅存在於內含子或非編碼區，也存在於編碼區及染色體上的其它任一區域[1]，大約每隔10～50kb就存在一個微衛星[5]。例如，豬基因組中存在著約65,000～100,000拷貝的二核苷酸重複單位AC/TG，平均每隔30～50kb就有一個[6]。
2.2高度多態，突變率低
在不同的個體中，微衛星重複單位數目的變異非常大，由此而造成了高度的長度多態性，並使其具有較高的信息。Dallas與Edwards等估計微衛星位點的突變率在10－4～5×10－6之間[7,8]。因此，微衛星具有較高的多態性但其突變率卻低於10－4，這在二者之間便有了一個很好的平衡。
2.3等位基因與基因型檢測方法簡便
一個高度多態序列的等位基因小於500bp並且變動範圍窄，則可以用PCR結合凝膠電泳法檢測，因而微衛星序列就很好地符合了上述標準。微衛星PCR擴增所需樣本量極少，並且由於微衛星序列較短，即使降解的DNA也可能包含足夠用來擴增的微衛星序列[9]。隨著高效精確的基因分型自動化技術的發展，微衛星基因型檢測將會更加快捷方便。
2.4共顯性標記
微衛星標記遵循孟德爾遺傳法則，呈共顯性遺傳，因此能很好地區分純合子與雜合子。
2.5微衛星引物的通用性
微衛星側翼序列的保守性以及物種間某些染色體區段的共線性，使得從一個物種獲得的引物可以套用於相關的分類群[10]。如deGortari等從牛的1036個微衛星引物中篩選出605個可在綿羊基因組中擴增，同源率約為58%[11]。隨著一些物種已克隆微衛星數目的增加，今後可望無須在另一些物種中重新克隆微衛星，這樣將會節省大量的人力物力。
2.6中性標記
在多數情況下，微衛星標記沒有任何表型效應，因而不存在對家畜個體的有害或次級效應。
3．微衛星標記在家畜遺傳育種研究中的套用
3.1遺傳圖譜構建
微衛星因其上述特點和優點而成為目前構建完整遺傳連鎖圖譜時的首選標記。基本思路是，以微衛星為基礎，在基因組中每隔一定距離找一個多態微衛星標記，當這些標記達到一定飽和度時（平均間隔不大於20cM並覆蓋90%以上基因組），便可據此繪製出一個基本的遺傳圖譜[2]。主要家畜如牛、綿羊、豬等的連鎖圖譜已建成，並且飽和度日趨增大。圖譜上的標記以微衛星為主，也散在有少量的RFLP、RAPD及I型標記[12]。
牛的第一張微衛星標記遺傳連鎖圖譜由Barendse於1994年建成[13]，至此已經又有幾個不同版本的牛遺傳連鎖圖譜繪製出。Kappes等發表的牛的第二代圖譜上有1236個標記，圖譜總長2990cM，常染色體上標記間平均距離為2.5cM[14]。到目前為止，已公布了四張豬的遺傳連鎖圖譜[15~18]。在最近版的豬遺傳連鎖圖譜上微衛星標記總計1042個，總長度2286.2cM，標記間平均距離為2.23cM。1992年Crawford等發表了第一張用微衛星標記構建的綿羊遺傳連鎖圖譜，當時所使用的微衛星標記很少。1998年deGortari等發表了綿羊的第二代遺傳連鎖圖譜，其上共有標記519個，其中504個為微衛星，常染色體圖譜總長度為3063cM，標記間距為6.4cM[19]。這種高密度遺傳連鎖圖譜的建成為基因定位、物理圖譜的構建及基因的位置克隆（Positionalcloning）奠定了基礎。
3.2數量性狀位點（QTL）定位
QTL定位就是以一定飽和度的遺傳連鎖圖譜為基礎，通過連鎖分析，確定家畜QTL在圖譜上的位置、與特定標記間的遺傳距離。QTL定位已成為目前家畜遺傳育種研究領域的一個熱點課題，其中基因組掃描（Genomescanning）是QTL定位的主要方法之一，即以已經構建的遺傳連鎖圖譜為基礎，利用連鎖分析的原理分析基因組中大量散在分布的多態性標記（多數為微衛星標記）與數量性狀變異的連鎖關係，進而藉助這些標記跟蹤對數量性狀表型有影響的功能基因在染色體上的位置及其效應，從而找到QTL[20]。Andersson等率先在一個由歐洲野公豬與大白豬建立的資源家系中發現豬4號染色體微衛星S0001～S0107區域存在脂肪沉積和背膘厚的QTL[21]。
3.3標記輔助選擇
藉助微衛星進行標記輔助選擇（Markerassistedselection，MAS）具有廣闊的套用前景。MAS的一個套用是有利基因的轉移。在傳統的回交育種過程中，隨著有利基因的引入，與有利基因連鎖的不利基因（或染色體片段）也會隨之導入，成為連鎖累贅。然而利用與目的基因緊密連鎖的微衛星標記，就可以直接選擇在目的基因附近發生重組的個體，從而避免或顯著減少連鎖累贅，提高選擇效率。MAS的另一套用是基因的累加。家畜有許多基因的表型是相同的，在這種情況下，經典的遺傳育種研究就無法區別不同的基因，因而無法鑑定一個性狀是受單個基因還是多個具有相同表型的基因共同控制。藉助微衛星標記，先在不同親本中將基因定位，然後通過雜交或回交將不同的基因轉移至一個品種中，通過檢測與不同基因連鎖的微衛星標記的基因型來判斷個體是否含有某個或幾個基因，以幫助選擇[22]。
3.4遺傳多樣性評估
家畜遺傳多樣性一般指品種內個體在DNA水平上的差異。通過對遺傳多樣性的評估，可了解家畜品種的遺傳結構、生活背景，分析其進化的歷史和潛力，以及探討品種瀕危的原因和現狀，提出合理的保種措施。為此，利用微衛星標記，檢測個體基因型，統計群體中的微衛星位點等位基因的數目和頻率，結合分子遺傳學和數量分類學原理，計算各個品種的遺傳變異程度、生存穩定性，初步評估品種的遺傳多樣性及品種間的關係親緣與分化關係[2]。Kacirek等利用18個微衛星分析了大白、約克夏及漢普夏三個豬種間的遺傳變異[23]。楊瀾利用5對牛微衛星引物和10對綿羊微衛星引物分析了5箇中國地方山羊品種的遺傳多樣性[24]。
3.5系譜確證
畜育種中必須搞清楚畜群的親子關係，這樣才能利於根據親屬信息準確選留個體並能防止群體近交的發生。然而在某些情況下（如寄養、母畜返情重配等），卻不能準確判斷某一個體的親代。如今藉助多個微衛星標記位點在群體中的等位基因頻率，通過計算排除率（Exclusionprobability）便可進行親子鑑定和血緣控制。Ellegren等研究表明，組合使用5個微衛星位點（每個位點有6個以上的等位基因）時排除率為98%，而使用10個這樣的微衛星時排除率可高達99.99%[25]。VanZereren等利用7對微衛星引物對4個比利時豬種進行親緣關係鑑定，排除率均超過95%[26]。可見使用這種方法對家畜進行系譜確證是非常適合的，因為基因型結構的基本元素對於親代和子代是完全相同的[27]。
