背景
次年，改任安徽巡警處會辦兼巡警學堂監督。時巡警學堂總辦毓秀並不到校視事，由監督主持校務。徐錫麟督課嚴正，常向學生灌輸振興民族、愛護祖國的革命思想，平日又以身作則，受到學生愛戴。並從學生和教職員中發展了一些革命骨幹。他還利用合法身份，與兵備處提調胡維棟、馬營管帶倪映典、步兵管帶薛哲、工程隊正目范傳甲及軍械所負責人周家煜等接觸。假日，常藉故約同志外出察看地形，籌划起義。光復會會員陳伯平、馬宗漢也先後來到安慶，協助起義的準備工作。徐錫麟說：“我有三百學生，直等三千子弟兵啊!”同時，光復會另一主要成員秋瑾在浙江亦準備起義。秋瑾等推徐錫麟為皖浙起義首領，約定皖浙兩地同時起義。為此，徐錫麟刻制“浙皖革命新軍總司令印”一方。
經過
三十三年(1907)五月，巡警學堂學生學習期滿。徐錫麟計畫乘五月二十八(7月8日)巡撫及各司道到校參加畢業典禮之機槍殺恩銘，造成群龍無首；同時約定城外新軍屆時回響。此時，光復會員葉仰高在上海被捕，供稱革命黨人光復會首領已進入安徽官場。兩江總督端方遂急電恩銘從速查辦。恩銘不知徐錫麟即為革命黨首領，將此事交他辦理。徐錫麟見事機緊迫，深恐生變，決定提前起義。剛巧二十八日恩銘需赴結盟弟兄張次山母親八旬壽宴，將畢業典禮改為二十六日舉行。徐錫麟遂決定是日起義。連夜與陳伯平、馬宗漢草擬《光復軍告示》：“為曉諭大眾，翦滅滿夷，除暴安民事：維我大漢民族，立國千年，文明首出，維古舊邦。乃自滿夷入關，中原塗炭，衣冠掃地，文獻無遺。二百餘年，偷生姑息，虐政之下，種種難堪，數不可罄。近則名為立憲，實乃集權中央，玩我股掌，禁止自由，殺戮志士，苛虐無道，暴政橫生。天下擾擾，民無所依，強鄰日逼，不可終日。推厥種種罪由，何莫非滿政府愚黔首虐漢族所致。以是余等懷抱公憤，共起義師，與我同胞，共復舊業，誓掃妖氛，重建新國，圖共和之幸福，報往日之深仇。義兵所臨，秋毫無犯，各安就業。我漢族諸父兄子弟，各安生業，無庸驚疑。如本軍軍士有來侵犯者，可首告軍前，本□□當治以應得之罪，勿稍寬縱。至若有不肖匪徒，妄譏義師，結眾抗衡，是甘為化外，自取罪戾，當表示天下，與我漢族諸父兄子弟共誅之。此諭。”
徐錫麟又在告示上加幾條“殺律”，即：滿人不降者殺；反抗本軍者殺；乘機搶掠者殺；造謠生事妨害治安者殺；仍為漢奸者殺。
二十六日清晨，徐錫麟在校集合學生，闡明革命道理，並出示警笛，約定緊急時嗚笛為號，學生當聞聲互助。8時許，恩銘及各司道先後到校。徐錫麟原打算先請恩銘喝酒，然後閱操，趁間起義。不料巡警學堂收支員顧松前往恩銘等身邊低語。徐錫麟意識到秘密可能泄露，乃請恩銘到操場閱操。9時，畢業典禮開始，恩銘來到操場，徐錫麟向其行禮，突告“今日有革命黨起事。”話音未落，陳伯平即向恩銘投一炸彈，未爆。徐錫麟見狀立即拔出雙槍，向恩銘猛射，陳伯平、馬宗漢也跟著開槍，恩銘倒地。文巡捕陸永頤身護恩銘中5彈而死，武巡捕車文德受重傷，道員巢鳳儀、安慶知府龔鎮湘亦受傷。文武官員，紛紛逃竄。顧松被馬宗漢槍殺。
徐錫麟集合未散學生，與陳伯平、馬宗漢率領急行至北門大珠子巷，占領軍械所，奪取槍械。但軍械所負責人周家煜臨陣怯逃，把庫門鑰匙帶走，庫門久砸不開。清軍趕到，陳伯平扼守前門，馬宗漢防堵後門。徐錫麟派人出城通知薛哲、倪映典等新軍前來接應。城門已閉，無法聯絡。下午，緝捕營管帶杜春林、中軍兼巡防營管帶劉利貞、稽查局候補知縣勞文琦及張勛所率的巡防營，把軍械所團團圍住。經數小時對抗，終因寡不敵眾，陳伯平中彈犧牲，徐錫麟、馬宗漢與學生數十人彈盡被捕。
藩司馮煦、臬司毓秀等會審徐錫麟。毓秀要他跪下，徐錫麟斥道：“不要洋洋得意，你要慢走一步，就被我殺了。”馮煦等叫他供出同黨，徐錫麟怒目而視，慷慨陳詞。徐錫麟從問話中悟到恩銘必死無疑，放聲大笑：“那么新甫(恩銘字)死了，他既死，我志已償，就是粉身碎骨也在所不惜!”隨即揮筆寫下供詞：
“我本革命黨大首領，捐道員到安慶，專為排滿而來。做官本是假的，使人人可無防備。滿人虜我漢族，將近三百載矣。觀其表面立憲，不過牢籠天下人心，實主中央集權，可以膨脹權勢。然實滿人之妄想，以為一立憲即不能革命，殊不知中國人之程度不夠立憲，以我理想，立憲是萬萬做不到。若以中央集權為立憲，越立憲，我漢人越死得快。我只拿定革命宗旨，一旦乘時而起，殺盡滿人，自然漢人強盛，再圖立憲未遲。我蓄志排滿有十餘年，今日始達目的。本擬殺恩銘，再殺鐵良、端方、良弼，為漢人復仇。乃竟於殺恩銘後，即被拿獲，實難滿意。我今日之意，僅欲殺恩銘與毓鐘山耳。恩銘想已擊死，可惜便宜毓鐘山。……爾等言撫台是好官，待我甚厚，但我既以排滿為宗旨，即不能問其人之好壞。至於撫台厚我，系屬個人私恩；我殺撫台，乃是排滿公理。……助我者僅光復子宗漢子兩人，不可拖累無辜。”訊畢攝影時，徐錫麟從容含笑，毫無懼色。當晚，徐錫麟就義於撫署東轅門外，並被剜心祭祀恩銘。被捕的巡警學堂學生朱蘊山、宋豫林、楊允中、姚向甫4人陪斬。恩銘衛隊兵士還將徐錫麟的心肝炒食下酒。
