簡介
實驗原理:細胞中的DNA受1MHC1,60℃水解作用以後,核酸中的嘌呤鹼很快完全被除掉,使脫氧核糖中潛在的醛基獲得自由狀態。水解後,組織要經水洗再移至希夫(Schiff)試劑中,希夫試劑即同露出來的醛基發生反應,呈現紫紅色。這個反應是Feulgen在1942年提出來的,是DNA的一個特異性檢查法。
水解的時間很重要,因為核酸的水解有兩個過程,第一,嘌呤鹼很快被除掉,脫氧核糖中潛在的醛基顯露出來,第二,組蛋白和核酸愈來愈多地被除掉。在短時間的水解作用以後,第一個過程占優勢,這時候用希夫試劑染色,染色體的染色作用最強。隨著水解作用的繼續進行,第二個過程逐漸變成優勢,因此水解液中的希夫反應增強,而染色體中的希夫應減弱。最後,第二個過程超過第一過程時,染色體也隨之停止反應。
希夫試劑是鹼性品紅———亞硫酸溶液,呈無色。與DNA醛基反應後,使鹼性品紅恢復原來的紅色。
實驗目的
觀察蠶豆根尖細胞或其它根尖細胞內染色體中的DNA,以及染色體在有絲分裂中的行為,掌握Feulgen染色方法。
實驗材料
上次實驗製成了石蠟切片。
實驗準備
1.用具 立式染色缸一套,鑷子,蓋玻片,小漏斗,鐵架,毛邊紙,玻璃棒,顯微鏡,恆溫水浴鍋,溫度計,燒杯,棕色瓶,黑紙。
2.玻璃器皿的清洗 主要是染色缸的清洗,一般用肥皂粉洗,用水沖淨即可,如不能洗淨時,要用洗液浸泡後,再沖洗,自來水洗後,再用少量蒸餾水過洗一次。盛放100%酒精、二甲苯的染色缸必須乾燥,缸蓋內緣必須塗以幾士林,以防止蒸發和收水分,影響濃度。染色缸上要貼上標籤。
3.實驗所需藥口及配製
濃鹽酸(36—38%),鹼性品紅,偏重亞硫酸鈉(Na2S2O5);
亞硫酸鈉(Na2SO3),固綠(fast green),加拿大中性樹膠乙醇(30—100%),二甲苯。
藥品配製
1各種濃度的乙醇配製.
21NHCI配製:取濃HCI 82.5毫升加蒸餾水至1000毫升,搖勻。
3Sciff 試劑的配製
0.5克鹼性品紅,加到已經煮沸的100毫升蒸餾水中,再煮沸3—4分鐘,待溶液冷卻到50℃時過濾,再等溶液冷到25℃以下時,加入10毫升的1NHCI和1。5克偏重亞硫酸鈉,裝在棕色瓶中,塞緊瓶子,用黑紙包好,放在暗處,第二天觀察,溶液還是淡紅色就不能用,只得重配。
偏重亞硫酸鈉與1NHCI反應,放出SO2,SO2與鹼性品紅反應,生成鹼性品紅--亞硫酸溶液,呈無色。
4漂染液的配製
先配10%的亞硫酸鈉溶液。
把10%亞硫酸鈉溶液10毫升加200毫升蒸餾水,再加10毫升1NHCI,即成漂當液。
5固綠染色液
0.5克固綠溶於100毫升95%乙醇溶液。
實驗步驟
2.水解 先在恆溫水浴箱中準備好恆溫60℃的1NHCI。注意一定要控制好溫度不能過高,高了醛基要破壞,低了水解不充分,醛基不能釋放出來。水解的時間長短要根據材料,以及固定液的種類而定。根據試驗結果,取一個適當時間。
因加拿大樹膠溶於二甲苯,所以片子一定要經二甲苯透明後才進行封片,操作方法如下:
1.用鑷子從二甲苯中取出載玻片,以毛邊紙吸乾余液。
2.左手開啟樹膠瓶,右手用瓶中玻璃棒蘸取樹膠滴於載玻片上,並隨即蓋好瓶蓋。樹膠的用量視蓋玻片大小而定。要使樹膠在蓋玻片下滿布,不發生過多或不足。
3鑷取潔淨蓋玻片,以一邊澆於載玻片上,然後徐徐放下,使樹膠布滿蓋玻片與載玻片之間。產生氣泡的原因是覆蓋太快樹膠用量不足,或樹膠過稠。氣泡侵入後,妨礙鏡檢,且使標本褪色。如有氣泡產生,則可以在靠近氣泡的一邊再滴樹膠一滴,然後輕壓蓋玻片,使氣泡逸出。
片子封片後,放在切片木框上,讓其自然乾燥,即可保存。