孚爾根染色法

DNA是主要的遺傳物質,集中於染色體上。1924年孚爾根首先用席夫試劑(Schiff)作試驗,鑑定了染色體上DNA的存在,故稱為孚爾根染色法。孚爾根染色法的反應原理主要與席夫試劑的化學性質有關,此試劑的基本成分是鹼性品紅,偏亞硫酸氫鈉(NaHSO3)和鹽酸·鹼性品紅的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。

簡介

實驗原理:細胞中的DNA受1MHC1,60℃水解作用以後,核酸中的嘌呤鹼很快完全被除掉,使脫氧核糖中潛在的醛基獲得自由狀態。水解後,組織要經水洗再移至希夫(Schiff)試劑中,希夫試劑即同露出來的醛基發生反應,呈現紫紅色。這個反應是Feulgen在1942年提出來的,是DNA的一個特異性檢查法。

水解的時間很重要,因為核酸的水解有兩個過程,第一,嘌呤鹼很快被除掉,脫氧核糖中潛在的醛基顯露出來,第二,組蛋白和核酸愈來愈多地被除掉。在短時間的水解作用以後,第一個過程占優勢,這時候用希夫試劑染色,染色體的染色作用最強。隨著水解作用的繼續進行,第二個過程逐漸變成優勢,因此水解液中的希夫反應增強,而染色體中的希夫應減弱。最後,第二個過程超過第一過程時,染色體也隨之停止反應。

希夫試劑是鹼性品紅———亞硫酸溶液,呈無色。與DNA醛基反應後,使鹼性品紅恢復原來的紅色。

實驗目的

觀察蠶豆根尖細胞或其它根尖細胞內染色體中的DNA,以及染色體在有絲分裂中的行為,掌握Feulgen染色方法。

實驗材料

上次實驗製成了石蠟切片。

實驗準備

1.用具 立式染色缸一套,鑷子,蓋玻片,小漏斗,鐵架,毛邊紙,玻璃棒,顯微鏡,恆溫水浴鍋,溫度計,燒杯,棕色瓶,黑紙。

2.玻璃器皿的清洗 主要是染色缸的清洗,一般用肥皂粉洗,用水沖淨即可,如不能洗淨時,要用洗液浸泡後,再沖洗,自來水洗後,再用少量蒸餾水過洗一次。盛放100%酒精、二甲苯的染色缸必須乾燥,缸蓋內緣必須塗以幾士林,以防止蒸發和收水分,影響濃度。染色缸上要貼上標籤。

3.實驗所需藥口及配製

濃鹽酸(36—38%),鹼性品紅,偏重亞硫酸鈉(Na2S2O5);

亞硫酸鈉(Na2SO3),固綠(fast green),加拿大中性樹膠乙醇(30—100%),二甲苯。

藥品配製

1各種濃度的乙醇配製.

21NHCI配製:取濃HCI 82.5毫升加蒸餾水至1000毫升,搖勻。

3Sciff 試劑的配製

0.5克鹼性品紅,加到已經煮沸的100毫升蒸餾水中,再煮沸3—4分鐘,待溶液冷卻到50℃時過濾,再等溶液冷到25℃以下時,加入10毫升的1NHCI和1。5克偏重亞硫酸鈉,裝在棕色瓶中,塞緊瓶子,用黑紙包好,放在暗處,第二天觀察,溶液還是淡紅色就不能用,只得重配。

偏重亞硫酸鈉與1NHCI反應,放出SO2,SO2與鹼性品紅反應,生成鹼性品紅--亞硫酸溶液,呈無色。

4漂染液的配製

先配10%的亞硫酸鈉溶液。

把10%亞硫酸鈉溶液10毫升加200毫升蒸餾水,再加10毫升1NHCI,即成漂當液。

5固綠染色液

0.5克固綠溶於100毫升95%乙醇溶液。

實驗步驟

2.水解 先在恆溫水浴箱中準備好恆溫60℃的1NHCI。注意一定要控制好溫度不能過高,高了醛基要破壞,低了水解不充分,醛基不能釋放出來。水解的時間長短要根據材料,以及固定液的種類而定。根據試驗結果,取一個適當時間。

因加拿大樹膠溶於二甲苯,所以片子一定要經二甲苯透明後才進行封片,操作方法如下:

1.用鑷子從二甲苯中取出載玻片,以毛邊紙吸乾余液。

2.左手開啟樹膠瓶,右手用瓶中玻璃棒蘸取樹膠滴於載玻片上,並隨即蓋好瓶蓋。樹膠的用量視蓋玻片大小而定。要使樹膠在蓋玻片下滿布,不發生過多或不足。

3鑷取潔淨蓋玻片,以一邊澆於載玻片上,然後徐徐放下,使樹膠布滿蓋玻片與載玻片之間。產生氣泡的原因是覆蓋太快樹膠用量不足,或樹膠過稠。氣泡侵入後,妨礙鏡檢,且使標本褪色。如有氣泡產生,則可以在靠近氣泡的一邊再滴樹膠一滴,然後輕壓蓋玻片,使氣泡逸出。

片子封片後,放在切片木框上,讓其自然乾燥,即可保存。

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