凝膠層析又稱凝膠過濾，是一種按分子量大小分離物質的層析方法。該方法是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然後用緩衝液洗脫。大分子不能進入凝膠顆粒中的靜止相中，只留在凝膠顆粒之間的流動相中，因此以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，並很快在流動相和靜止相之間形成動態平衡，因此就要花費較長的時間流經柱床，從而使不同大小的分子得以分離。
凝膠過濾柱層析所用的基質是具有立體網狀結構、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質。這種物質可以完全或部分排阻某些大分子化合物於篩孔之外，而對某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配係數Kav（被分離化合物在內水和外水體積中的比例關係）表示。Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關，即：
Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的層析條件下，Vt和Vo都是恆定值，而Ve值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，Kav值小；反之，則Kav值增大。
通常選用藍色葡聚糖2000作為測定外水體積的物質。該物質分子量大（為200萬），呈藍色，它在各種型號的葡聚糖凝膠中都被完全排阻，並可藉助其本身顏色，採用肉眼或分光光度儀檢測（210nm或260nm或620nm）洗脫體積（即Vo）。但是，在測定激酶等蛋白質的分子量時，宜用藍色葡聚糖2000測定外水體積，因為它對激酶有吸附作用，所以有時用巨球蛋白代替。測定內水體積（Vi）的物質，可選用硫酸銨、N-乙醯酪氨酸乙酯，或者其它與凝膠無吸附力的小分子物質。
本實驗使用血紅蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－魚精蛋白（DNP－魚精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通過SephadexG－25層析後達到分離。
