概述
編程性死亡細胞的核DNA在核小體連線處斷裂成核小體片段,並向核膜下或中央異染色質區聚集形成濃縮的染色質塊。隨著染色質不斷聚集,核纖層斷裂消失,核膜在核孔處斷裂,形成核碎片。同時在編程性死亡過程中,由於不斷脫水,細胞質不斷濃縮,細胞體積減小。調亡細胞經核碎裂形成的染色質塊(核碎片),然後整個細胞通過發芽(by budding)、起泡(byzelosls)等方式形成一個球形的突起,並在其根部絞窄而脫落形成一些大小不等,內含胞質、細胞器及核碎片的小體稱為凋亡小體。
細胞死亡作為生物體的一種常見現象,一般可分為兩種類型:細胞壞死(necrosis)和細胞程式性死亡(programmedcelldeath,PCD)。後者也稱細胞凋亡(apoptosis)。細胞壞死是細胞在遭受極度刺激時引起的細胞死亡,以細胞質膜的破裂為特徵,造成內含物的炎性泄露,是一種非正常死亡。細胞凋亡是細胞的一種“主動性”死亡行為,由基因控制,表現為細胞染色質凝集並邊緣化、細胞濃縮、凋亡小體產生及DNA片段化等。由於片段化而形成180bp-200bp的DNALadder被認為是細胞凋亡的典型特徵。
線粒體與凋亡小體
細胞程式性死亡被分為兩類:受體介導的細胞程式性死亡和線粒體介導的細胞程式性死亡。本實驗主要涉及到線粒體介導的凋亡途徑。線粒體可以進行氧化磷酸化並產生ATP,同時它還可以誘導產生PCD發生的物質-細胞色素C(cytC)的泄漏。線粒體膜上存在Bax組成的孔道。Bcl-2等抑制它的開放,從而抑制PCD因子的釋放和阻止PCD的發生。而Bad等促進Bax開放,從而導致Apaf:apoptosisproteaseactivatingfactor活化,使cytC的釋放,促進CytC,Apaf-1,caspase-9複合物的形成,使得細胞處於細胞凋亡的執行階段。凋亡的標準特徵之一,是基因組DNA斷裂為180-200bp的多條寡核小體片段。此現象可用常規瓊脂糖凝膠電泳檢測,是凋亡的特徵。DNA梯狀序列最後可在紫外燈下顯示,人們可以照像記錄它的電泳行為。根據DNA的電泳行為,人們就可以判斷出細胞死亡的類型。凋亡細胞形成明顯的梯狀DNA,壞死細胞為不清晰彌散狀DNA,而活細胞DNA在瓊脂糖凝膠的頂部,是一個沒有受到切割的高分子量條帶。
Cytc是電子傳遞鏈的重要組成部分,定位於線粒體內,是真核細胞內不可缺少的重要因子。但當他溢出線粒體後就會誘導細胞凋亡。在本實驗中,對洋蔥內表皮、菸草懸浮細胞或人口腔內皮細胞等加入Cytc或其他誘導物,觀察誘發產生的凋亡細胞。用改良苯酚品紅染色觀察凋亡細胞核發生染色質凝集(condensation)、趨邊化(margination)、DNA裂解(fragmentation)產生凋亡小體等形態學上的變化,用瓊脂糖凝膠DNA電泳檢測細胞凋亡後形成的DNALadder。