四川綿竹市鵬發生化有限責任公司
（原綿竹竹生生物化學製品有限公司、綿竹生化製藥廠），始建於1990年，
是一家專業生產胺基酸系列產品的外向型民營企業，占地面積25000平方米，擁有固定資產460萬元。
十多年來，我公司一直堅持以科學技術進步為主導，開發新產品為龍頭，以生化產業的優惠政策和良好的市場
前景為優勢，以提高經濟效益為中心。到現在以形成年產250噸L－胱氨酸、60噸L－精氨酸、300噸L－半胱氨酸一水
物、100噸L－半胱氨酸無水物、50噸L－酪氨酸、50噸L－亮氨酸 、36 噸 L －焦谷氨酸、 360 噸L －谷氨酸 、
1000 噸氯化銨、 乙醯等系列產品生產加工一條龍的多功能生化企業。
在激烈的市場競爭中，企業牢牢把握“外抓市場，內抓管理；艱苦創業，高質高效；求實創新，開拓進取。”
的治廠方針。始終堅持“質量第一 用戶至上”的宗旨，使企業樹立了良好的外部形象。歷年來，除了與國內大批
客戶友好合作，還迎來多國外商的稱讚和簽訂長期供貨契約。
公司已取得了ISO9001質量體系認證，按《質量管理體系要求》建立、實施。為確保對公司質量管理體系過程
的有效策劃和控制，公司規定對每一項與質量有關的活動都要按預先確定的程式進行，以消除和預防不利於質量因
素的影響，保證提供給顧客的產品和服務達到規定的質量水平。
相關內容
（1）選擇合適的限制酶，以便定點切割靶DNA和載體DNA。
（2）選擇能夠進行自我複製的小分子DNA，如質粒或病毒作為載體DNA。
冠癭胺基酸（3）製備所需要的DNA片段。
（4）用DNA連線酶連線載體DNA和目的基因，使它們形成重組DNA分子。
（5）選擇合適的方法把重組 DNA分子送入細胞，由細胞提供 DNA複製的環境條件。另外，還要選擇一種能夠檢測重組DNA是否進入細胞的方法，即篩選含重組子的細胞克隆。用於完成上述步驟及有關任務的方法統稱為重組DNA技術。
2．限制性內切酶存在於許多種細菌中。這些限制酶的功能是識別和降解外來的 DNA，而細胞本身的DNA不被切割。這是因為存在限制性內切酶的細胞中還有另一種酶即共座甲基化酶，它能識別限制性內切酶所識別的核普酸序列，並把其中的某些鹼基進行甲基化修飾，因而避免了限制酶對自身DNA的破壞；外來的DNA分子，因為沒有甲基化標記，作為異己而易被限制酶切割。
3．要使外源DNA片段能在宿主細胞內複製，必須有特殊“載體” 的幫助。通過它，外源 DNA可進入受體細胞擴增。這種使外源 DNA得到克隆擴增的 DNA稱為載體 DNA。載體DNA應具備下列特徵：
（1）是宿主細胞本來就具有的或是宿主細胞完全可接受的 DNA分子；
（2）它的分子量要儘量小，它不僅能在宿主細胞內獨立地進行複製，而且也能複製它所連線的DNA分子；
（3）載體DNA經限制酶切割後，仍不失自我複製能力；
（4）載體DNA應攜帶可供篩選的遺傳標記，在外源DNA插入後，這些特徵可作為重組DNA的選擇標記。如 SC101質粒含有抗四環素的基因，質粒上有一個 ECORI酶切位點，酶切後不破壞抗四環素基因，結合外源 DNA後也不會損傷該基因。
在原核生物的DNA重組中常用的載體是質粒和噬菌體。酵母和動物病毒等常用作真核生物克隆的載體。
4．質粒是細菌染色體外的遺傳因子，通常為雙鏈環狀的DNA。質粒能自主地進行複製，這 樣它才能隨著細菌細胞的分裂而穩定的遺傳。在天然條件下，一些質粒可通過類似於細菌接合的方式從一宿主轉移到另一宿主細胞，這類質粒稱為游離體。但這類質粒不適合作載體，需經改造使之不在細胞間轉移，以使危險基因不致被傳遞。通過“轉化”，質粒進入細胞後，使受體菌獲得新的遺傳特性。因為質粒上往往攜帶一些特殊的基因，如有 些質粒上有產生大腸桿菌素的基因，使大腸桿菌可以分泌大腸桿菌素，以殺死外來的細菌。有些質粒上有“鈍化”抗生素如四環素的基因，使大腸桿菌在含有四環素的培養基上仍能生長，此稱為抗藥性。這些特性可用於篩選獲得重組子的克隆。
5．質粒作載體簡單易行。質粒作為載體儘管有許多優點，但所攜帶的外源 DNA只限於10kb以內的小分子 DNA片段。因細菌轉化的效率隨著質粒分子量的增加而下降。一些較大的DNA片段可用噬菌體人作為載體進行克隆。使用噬菌體入作為克隆載體是基於它的三個重要的特性。
（1）λ噬菌體顆粒中的 DNA是線狀雙鏈DNA，該病毒基因組中約 1／3的 DNA是非必須的，因此可以用外來的DNA替換之。
（2）λ噬菌體可允許插入的 DNA長達 23kb，一旦人噬菌體的 DNA片段和大小合適的外源 DNA片段相連線，所產生的重組 DNA分子在加入含有完成噬菌體包裝所需的所有蛋白質的細菌細胞抽提物時，它們能被組裝成噬菌體顆粒。此過程叫做體外包裝，這樣獲得的噬菌體就能把重組DNA分子送入細胞。
（3）λ噬菌體侵染大腸桿菌，可以在宿主細胞內增殖，並使細胞裂解放出約100個噬菌體顆粒，使外源DNA得以克隆和擴增。
7．多數農桿菌中含有一個大的質粒（約200kb）叫做Ti質粒，Ti質粒上有一段DNA，稱為 T－DNA（transferred DNA，約 23kb）；當農桿菌和一個植物細胞接觸時，它所含的質 粒中的T－DNA片段在質粒轉化入植物細胞中時，能整合到植物核染色體的隨機位點，並導致冠癭瘤的形成。T－DNA以外的一個約35kb的區域內含有毒性基因（Vir）。該毒性基因的產物對T－DNA的轉移及整合是必需的。這個T－DNA編碼的酶改變植物的代謝物，形成兩種對細菌很重要的化合物。第一類是植物的生長激素植物生長素和細胞分裂素。它們刺激植物細胞生長，轉化植物細胞形成冠癭。第二類化合物叫冠癭胺基酸或冠癭瘦鹼，它是一類細菌的食物來源，其化學本質是一類胺基酸衍生物。如蟑魚鹼是精氨酸與丙酮酸縮合而成的化合物，農桿鹼是谷氨酸的二環糖衍生物。冠癭胺基酸在腫瘤內被大量合成並分泌到周圍，它們僅能由細菌用Ti質粒編碼的酶所代謝。
把T－DNA轉入植物基因組的細菌系統能用來轉入重組DNA。
冠癭胺基酸8．DNA文庫（DNA library）是由一個基因組產生的所有 DNA片段克隆的總稱。簡單地 說，就是把某一基因組DNA切割成成千上萬個片段，把這些片段全部克隆。於是，這些DNA片段的全部克隆含有一個生物體的全部遺傳信息。就像人類知識都儲存在圖書館中一樣。建立DNA文庫的基本方法是：
（1）純化載體DNA； （2）用相同的限制性內切酶分別切割載體DNA和基因組DNA，並經蔗糖密度梯度離心純化切割後的基因組DNA片段，去掉太大或過小的片段；
（3）將純化的基因組 DNA片段與切開的載體 DNA混合併連線，產生的“連線混合物”用於轉化細菌細胞或包裝成噬菌體顆粒。讓重組噬菌體轉染細菌細胞，這樣便產生了含有不同重組DNA分子的一群細菌細胞或噬菌體。從理論上講，幾乎所有的這個基因組的DNA都可能存在於這個DNA文庫中。以這種方法建立的“DNA圖書館” 叫做“基因組文庫”。每個細菌細胞生長成一個菌落或稱一個“克隆”；每個“克隆” 中的細胞含有相同的重組DNA分子。在噬菌體構成的“文庫” 中，每個重組噬菌體產生一個噬菌斑，即瓊脂培養基上細菌“草坪” 中細胞被溶解產生的半透明的環斑。在一個噬菌斑中的所有重組噬菌體都是相同的。
9．由於許多真核生物基因是內含子和外顯子的嵌合體，為了建立更專門更特異的文庫以克 隆那些在某個器官或組織的細胞中才能表達的基因，可從這些器官或組織的細胞中分離純化出mRNA，經反轉錄酶催化產生與之互補的DNA，即 cDNA，將這些cDNA插入載體進行克隆，產生的克隆群體叫做cDNA文庫。
如胰島素原的製備，從胰腺組織細胞中分離出胰島素原的mRNA，在反轉錄酶的作用下，產生胰島素原的cDNA；將胰島素原的 cDNA插入質粒構成一個重組質粒，經轉化，重組質粒可進入大腸桿菌細胞，胰島素原便可在細菌細胞中合成。
10．一般的方法是把一張硝酸纖維膜平展均勻地壓在含有許多經“轉化”處理的受體茵茵落的培養皿表面，這些菌落含有不同的重組DNA分子。於是每個菌落的一些細胞粘到了硝酸纖維膜上，形成一個複印版。將硝酸纖維膜用鹼處理，以裂解粘附在上面的細胞並把DNA變性，這些變性單鏈DNA仍被吸附在硝酸纖維膜上原菌落所在的位置，然後用帶有放射性的互補DN A或RN A片段作為探針處理膜，探針將和有互補順序的DNA退人雜交。這樣就可用放射自顯影的方法找到能和探針雜交的菌落，也就找到了含有目的DNA順序的克隆。
克隆基因的表達
生物有機體的遺傳信息都是以基因的形式儲存在細胞的遺傳物質DNA分子上的，而DNA分子的基本功能之一，就是把它所承載的遺傳信息轉變為由特定胺基酸順序構成的多肽或蛋白質(包括酶)分子，從而決定生物有機體的遺傳表型。這種從DNA到蛋白質的過程叫做基因的表達(gene expression)。
在大腸桿菌細胞中，參與特定新陳代謝的基因是趨於成簇地集成一個轉錄單位，即操縱子。在操縱子中，主要的控制片段，包括操縱基因和啟動子，是位於它的起始部位。在基因表達過程中，操縱子先轉錄成多順反子mRNA，然後再從多順反子mRNA轉譯成多肽分子。為了使克隆的外源基因能夠在細菌寄主中實現功能表達，就必須使基因置於寄主細胞的轉錄和mRNA分子的有效轉譯控制之下。而且在有的情況下，還涉及到表達產物蛋白質分子的轉譯後修飾的問題。所以，並非所有的基因表達都是始終如一的，有些要受細胞內外環境的調節。
另外，利用各種先進的基因導入技術及細胞培養方法也已成功實現了外源基因在動、植物及酵母等真核宿主細胞中的表達。
利用真核細胞作宿主表達系統的優點是：
① 真核細胞能夠識別和除去外源基因中的內含子，剪接加工形成成熟的mRNA。也就是說含有內含子的天然基因在真核細胞中是可以利用的，這是原核細胞辦不到的。
② 真核細胞將表達的蛋白糖基化，而大腸桿菌表達的蛋白是沒有糖基化的，糖基化對某些表達蛋白的免疫原性影響很大。
但真核細胞作宿主表達系統尚存在以下幾個問題：
① 選擇標記及選擇系統只有少數幾個；
② 轉化效率低，一般只有10-6～10-4；
③ 外源基因轉移並整合到細胞染色體DNA上帶有一定的自發性和盲目性，整合的拷貝數和位置都還不能控制；
④ 細胞培養及細胞的挑選要求比較高，手續繁瑣費時。此外，細胞大量培養還有不少問題，而且成本較高，利用培養細胞方式大量生產某些表達蛋白，從工藝到成本都要很好地考
