western免疫印記

1、用0.01M 3、棄包被液，用0.01M 7、棄二抗，用0.01M

Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然後利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。
一、原理
與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分 離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載 體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表 達的蛋白成分。該技術也廣泛套用於檢測蛋白水平的表達。
二、試劑準備
1、SDS-PAGE試劑:見電泳實驗。
2、勻漿緩衝液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.OML；10%SDS 6.0ml；β-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。
3、轉膜緩衝液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。
5、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。
6、封被液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0g 溶於20ml的0.01M PBS中。
7、顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H202 1.0μl。
三、操作步驟
（一）蛋白質樣品獲得：細菌誘導表達後，可通過電泳上樣緩衝液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩衝液，機械或超音波室溫勻漿0.5-1min。然後4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。
（二）電泳：製備電泳凝膠，進行SDS-PAGE。
（三）轉移：（半乾式轉移）
1、電泳結束後將膠條割至合適大小，用轉膜緩衝液平衡，5min×3次。
2、膜處理：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉膜緩衝液中10min。
3、轉膜：轉膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多餘的液體吸乾。接通電源,恆流1mA/cm2，轉移1.5hr。轉移結束後，斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色，放入膜染色液中50s後，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然後用雙蒸水洗，風乾夾於兩層濾紙中保存，留與顯色結果作對比。
（四）免疫反應：
1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。
2、加入包被液，平穩搖動，室溫2hr。
3、棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。
4、加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4℃ 放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其餘步驟與實驗組相同。
5、棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。
6、加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋），平穩搖動，室溫2hr。
7、棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。
8、加入顯色液，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。
四、注意事項
1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經過預實驗確定最佳條件。
2、顯色液必須新鮮配置使用，最後加入H2O2。
3、DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細。